[合集]生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告15篇

　　在人們素養(yǎng)不斷提高的今天，越來越多人會(huì)去使用報(bào)告，不同的報(bào)告內(nèi)容同樣也是不同的。為了讓您不再為寫報(bào)告頭疼，下面是小編收集整理的生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告，供大家參考借鑒，希望可以幫助到有需要的朋友。

生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告1

　　生物學(xué)是一門以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的自然科學(xué)，現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展尤其依賴科學(xué)實(shí)驗(yàn)。在生物中，實(shí)驗(yàn)、學(xué)習(xí)和觀察等實(shí)踐環(huán)節(jié)對(duì)我們掌握生物學(xué)知識(shí)、科學(xué)方法、培養(yǎng)我們的動(dòng)手能力和形成科學(xué)素質(zhì)都起到了至關(guān)重要的作用。正是因此，從我們開始接觸生物這門學(xué)科開始，就不斷有生物實(shí)驗(yàn)課程，鍛煉我們各式各樣的能力。

　　但是，也的確是上過各式各樣的生物實(shí)驗(yàn)課，我才更加深刻的感受到這次做的現(xiàn)代生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)對(duì)我的影響有多大。

　　老師在第一次課上，對(duì)我們?cè)敱M的講解了我們此學(xué)期需要完成的一系列實(shí)驗(yàn)。其中全是環(huán)環(huán)相扣，嵌合緊密，有點(diǎn)一招即失，滿盤皆輸?shù)膲毫�，不過我們更多的是懷著一種躍躍欲試的激動(dòng)，恨不得立馬動(dòng)手，靠著自己學(xué)來的知識(shí)，認(rèn)真的完成這套實(shí)驗(yàn)，并且還能看到最終那令人欣喜的結(jié)果。就這么妄想著妄想著，我們從第二周開始的現(xiàn)代生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)的漫長旅程。

　　由于，老師沒有硬性的要求實(shí)驗(yàn)時(shí)間，我們便是一有空閑就往實(shí)驗(yàn)室里鉆，也就少了以前實(shí)驗(yàn)課上出現(xiàn)的，因?yàn)椴糠謱?shí)驗(yàn)儀器的數(shù)量缺少，同學(xué)們每次做實(shí)驗(yàn)都是你推我嚷的，造成了實(shí)驗(yàn)興趣的流失。以至于做實(shí)驗(yàn)的態(tài)度越來越渙散，甚至只是簡單的走下過場而已，幾次實(shí)驗(yàn)課下來，熱情全無。但按照金老師的提議來，大家來實(shí)驗(yàn)的時(shí)間不同，使得對(duì)儀器使用的時(shí)間錯(cuò)開，減少了為爭搶儀器或是藥品而嘈雜不堪的場面，實(shí)驗(yàn)也變得順利了許多。

　　金老師會(huì)很體諒一些先開始忙活的同學(xué)，在黑板上寫清他們實(shí)驗(yàn)大概會(huì)做到的步驟和注意事項(xiàng)，后面實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備物品和要求，然后開始在忙于實(shí)驗(yàn)而奔走中的同學(xué)之間晃悠。觀察我們的實(shí)驗(yàn)操作，或是時(shí)不時(shí)提點(diǎn)解釋一下我們實(shí)驗(yàn)步驟的緣由；實(shí)驗(yàn)藥品的作用；如何做會(huì)得到更好的結(jié)果；實(shí)驗(yàn)沒有得到好的結(jié)果或是做的失敗了的原因。可是，隨著實(shí)驗(yàn)的發(fā)展，后來更多的時(shí)候，是我們?cè)诳催^書本上要求的實(shí)驗(yàn)步驟后，去纏著金老師，圍在他周圍，問他關(guān)于實(shí)驗(yàn)的各種問題，就算同樣的問題被問過許多次，金老師依然是和藹的笑著一一解答我們的疑問，他的平易近人，他的悉心教導(dǎo)，他的不驕不躁，他的耐性與笑容都深深的打動(dòng)了實(shí)驗(yàn)中的每位同學(xué)。

　　其實(shí)，他的這種教學(xué)方式，亮點(diǎn)就在于此，自主實(shí)驗(yàn)迫使我們會(huì)仔細(xì)品味步驟中的點(diǎn)滴；實(shí)驗(yàn)過程中的出現(xiàn)的各種問題，就要求我們會(huì)去思考如何排除，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不理想，更是強(qiáng)迫我們能認(rèn)真回顧實(shí)驗(yàn)中的任何細(xì)節(jié)，找出問題所在，也會(huì)需要我們?nèi)ド钊肓私膺@步實(shí)驗(yàn)的機(jī)理，用藥品的理由，實(shí)驗(yàn)操作要求等。這些自己通過自己動(dòng)手動(dòng)腦而逐步累積起來的經(jīng)驗(yàn)，是在以往任何時(shí)候都沒有獲得過的，那時(shí)，只知道按照老師和書本上寫的步驟來，根本不在意為什么要這么做，于是少了對(duì)實(shí)驗(yàn)的探究，能學(xué)到的東西自然也減少。

　　說完對(duì)金老師和老師方式的看法，其次我想談?wù)�，我在這樣的教學(xué)指導(dǎo)下獲得的收獲。

　　我是一個(gè)很懶散的人，以前做實(shí)驗(yàn)，大部分都是照本宣科，很少動(dòng)腦筋去思考實(shí)驗(yàn)的前因后果，對(duì)臺(tái)上老師的講解也都是一知半解的混著。但是，這次實(shí)驗(yàn)著實(shí)讓我很費(fèi)了一番腦子，有深入的去了解個(gè)中原理，實(shí)驗(yàn)操作的機(jī)理，儀器的.使用方法，幫助我糾正和熟練許多操作，同時(shí)讓我認(rèn)識(shí)到自己以前的迷糊與不負(fù)責(zé)任，也讓我體會(huì)到全身心的投入到一件事中，是如此快樂和滿足，還得到了好多在課堂上永遠(yuǎn)無法獲得的知識(shí)。下面，具體說說看我的幾件不小的收獲。

　　第一件，混實(shí)驗(yàn)室久了，我有了可以“變出”任何大家想要的器皿的“功能”，只要是實(shí)驗(yàn)室里有的且我們熟知的物品（老師打包裝起來的不算），無論是藥品試劑，還是不同規(guī)格的量筒試管，我都可以摸出來，省去了四處找老師尋求幫助的時(shí)間和氣力。

　　第二件，學(xué)會(huì)了配置許多的試劑，于是知道了不同的試劑配置需要注意的問題，鞏固了某些藥品相關(guān)的知識(shí)，并且在多次配置時(shí)，得出了一個(gè)結(jié)論：如果不是很熟悉的試劑配方，最好是拿一個(gè)專門的本子記錄下來，以備不時(shí)之需，這樣一來，以后實(shí)驗(yàn)也不會(huì)因?yàn)樵噭┑膯栴}而手忙腳亂。

　　第三件，實(shí)驗(yàn)步驟需要仔細(xì)的斟酌其中的奧秘，每一步如此走，自然有前人的用意，畢竟這些實(shí)驗(yàn)都是過去的科學(xué)家研究出來的精華繼承，理解了他們的意圖和原由，做起實(shí)驗(yàn)來會(huì)更加的得心應(yīng)手也不易遺忘或出錯(cuò)。

　　第四件，這件是我最大的心得，也不全是從此次實(shí)驗(yàn)中得來，且也不是只能運(yùn)用于做實(shí)驗(yàn)中，這份心得是：在決定要做的事情后，最好考慮清楚行動(dòng)時(shí)會(huì)需要用些什么，做些什么，將準(zhǔn)備工作做好，為后續(xù)行動(dòng)鋪墊，按其規(guī)律列好清單，會(huì)使得實(shí)驗(yàn)或者任何別的事情做得更加順利，有條理，排除做過多無用功的可能性，提高了效率的同時(shí)還降低錯(cuò)誤失誤的出現(xiàn)概率，成功率也會(huì)增高。

　　以上是我這個(gè)學(xué)期里，從現(xiàn)代生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)里得到的一些心得。我希望在下個(gè)學(xué)期里，我能將自己從這里得到的心得，學(xué)習(xí)應(yīng)用到其他的實(shí)驗(yàn)甚至是學(xué)習(xí)生活中去，擴(kuò)充自己的知識(shí)，拓寬自己的視野，增厚自己的底蘊(yùn)，加強(qiáng)自己的能力，不敢放言稱自己要成為未來生物界中的一流人才，只能勉勵(lì)自己成為一個(gè)不負(fù)眾望的有用的人。

生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告2

　　實(shí)驗(yàn)一觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布

　　實(shí)驗(yàn)原理：DNA綠色，RNA紅色

　　分布：真核生物DNA主要分布在細(xì)胞核中，線粒體和葉綠體內(nèi)也含有少量的DNA;RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞核呈綠色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

　　實(shí)驗(yàn)二物質(zhì)鑒定

　　還原糖+斐林試劑磚紅色沉淀

　　脂肪+蘇丹III橘黃色

　　脂肪+蘇丹IV紅色

　　蛋白質(zhì)+雙縮脲試劑紫色反應(yīng)

　　1、還原糖的檢測

　　(1)材料的選取：還原糖含量高，白色或近于白色，如蘋果，梨，白蘿卜。

　　(2)試劑：斐林試劑(甲液：0.1g/mL的NaOH溶液，乙液：0.05g/mL的CuSO4溶液)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　(3)步驟：取樣液2mL于試管中→加入剛配的斐林試劑1mL(斐林試劑甲液和乙液等量混合均勻后再加入)→水浴加熱2min左右→觀察顏色變化(白色→淺藍(lán)色→磚紅色)

　　★模擬尿糖的檢測

　　1、取樣：正常人的尿液和糖尿病患者的尿液

　　2、檢測方法：斐林試劑(水浴加熱)或班氏試劑或尿糖試紙

　　3、結(jié)果：(用斐林試劑檢測)試管內(nèi)發(fā)生出現(xiàn)磚紅色沉淀的是糖尿病患者的尿液，未出現(xiàn)磚紅色沉淀的是正常人的尿液。

　　4、分析：因?yàn)樘悄虿』颊叩哪蛞褐泻�有還原糖，與斐林試劑發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生磚紅色沉淀，而正常人尿液中無還原糖，所以沒有發(fā)生反應(yīng)。

　　2、脂肪的檢測

　　(1)材料的選�。汉�脂肪量越高的組織越好，如花生的子葉。

　　(2)步驟：制作切片(切片越薄越好)將最薄的花生切片放在載玻片中央

　　染色(滴蘇丹Ⅲ染液2～3滴切片上→2～3min后吸去染液→滴體積分?jǐn)?shù)50%的酒精洗去浮色→吸去多余的酒精)

　　制作裝片(滴1～2滴清水于材料切片上→蓋上蓋玻片)

　　鏡檢鑒定(顯微鏡對(duì)光→低倍鏡觀察→高倍鏡觀察染成橘黃色的脂肪顆粒)

　　3、蛋白質(zhì)的檢測

　　(1)試劑：雙縮脲試劑(A液：0.1g/mL的NaOH溶液，B液：0.01g/mL的CuSO4溶液)

　　(2)步驟：試管中加樣液2mL→加雙縮脲試劑A液1mL，搖勻→加雙縮尿試劑B液4滴，搖勻→觀察顏色變化(紫色)

　　考點(diǎn)提示：

　　(1)常見還原性糖與非還原性糖有哪些?

　　葡萄糖、果糖、麥芽糖都是還原性糖;淀粉、蔗糖、纖維素都是非還原性糖。

　　(2)還原性糖植物組織取材條件?

　　含糖量較高、顏色為白色或近于白色，如：蘋果、梨、白色甘藍(lán)葉、白蘿卜等。

　　(3)研磨中為何要加石英砂?不加石英砂對(duì)實(shí)驗(yàn)有何影響?

　　加石英砂是為了使研磨更充分。不加石英砂會(huì)使組織樣液中還原性糖減少，使鑒定時(shí)溶液顏色變化不明顯。

　　(4)斐林試劑甲、乙兩液的使用方法?混合的目的?為何要現(xiàn)混現(xiàn)用?

　　混合后使用;產(chǎn)生氫氧化銅;氫氧化銅不穩(wěn)定。

　　(5)還原性糖中加入斐林試劑后，溶液顏色變化的順序?yàn)椋簻\藍(lán)色棕色磚紅色

　　(6)花生種子切片為何要薄?只有很薄的切片，才能透光，而用于顯微鏡的觀察。

　　(7)轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋時(shí)，若花生切片的細(xì)胞總有一部分清晰，另一部分模糊，其原因一般是什么?切片的厚薄不均勻。

　　(8)脂肪鑒定中乙醇作用?洗去浮色。

　　(9)雙縮脲試劑A、B兩液是否混合后用?先加A液的目的。怎樣通過對(duì)比看顏色變化?

　　不能混合;先加A液的目的是使溶液呈堿性;先留出一些大豆組織樣液做對(duì)比。

　　實(shí)驗(yàn)三觀察葉綠體和細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)

　　1、材料：新鮮蘚類葉、黑藻葉或菠菜葉，口腔上皮細(xì)胞臨時(shí)裝片

　　2、原理：葉綠體在顯微鏡下觀察，綠色，球形或橢球形。

　　用健那綠染液染色后的口腔上皮細(xì)胞中線粒體成藍(lán)綠色，細(xì)胞質(zhì)接近無色。

　　知識(shí)概要：

　　取材制片低倍觀察高倍觀察

　　考點(diǎn)提示：

　　(1)為什么可直接取用蘚類的小葉，而不能直接取用菠菜葉?

　　因?yàn)樘\類的小葉很薄，只有一層細(xì)胞組成，而菠菜葉由很多層細(xì)胞構(gòu)成。

　　(2)取用菠菜葉的下表皮時(shí)，為何要稍帶些葉肉?

　　表皮細(xì)胞除保衛(wèi)細(xì)胞外，一般不含葉綠體，而葉肉細(xì)胞含較多的葉綠體。

　　(3)怎樣加快黑藻細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)速度?最適溫度是多少?進(jìn)行光照、提高水溫、切傷部分葉片;25℃左右。

　　(4)對(duì)黑藻什么部位的細(xì)胞觀察，所觀察到的細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)的現(xiàn)象最明顯?葉脈附近的細(xì)胞。

　　(5)若視野中某細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)方向?yàn)轫槙r(shí)針，則在裝片中該細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的實(shí)際流動(dòng)方向是怎樣的?仍為順時(shí)針。

　　(6)是否一般細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)不流動(dòng)，只有黑藻等少數(shù)植物的細(xì)胞質(zhì)才流動(dòng)?

　　否，活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)都是流動(dòng)的。

　　(7)若觀察植物根毛細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)，則對(duì)顯微鏡的視野亮度應(yīng)如何調(diào)節(jié)?

　　視野應(yīng)適當(dāng)調(diào)暗一些，可用反光鏡的平面鏡來采光或縮小光圈。

　　(8)在強(qiáng)光照射下，葉綠體的向光面有何變化?葉綠體的受光面積較小有一面面向光源實(shí)驗(yàn)四觀察有絲分裂。

　　1、材料：洋蔥根尖(蔥，蒜)

　　2、步驟：

　　(一)洋蔥根尖的培養(yǎng)

　　(二)裝片的制作

　　制作流程：解離→漂洗→染色→制片

　　1.解離：藥液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的.鹽酸，體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精(1：1混合液)。時(shí)間：3~5min.目的：使組織中的細(xì)胞相互分離開來。

　　2.漂洗：用清水漂洗約10min.目的：洗去藥液，防止解離過度，并有利于染色。

　　3.染色：用質(zhì)量濃度為0.01g/mL或0.02g/mL的龍膽紫溶液(或醋酸洋紅液)染色3~5min。目的：使染色體著色，利于觀察。

　　4.制片：將根尖放在載玻片上，加一滴清水，并用鑷子把根尖弄碎，蓋上蓋玻片，在蓋玻片上再加一片載玻片。然后用拇指輕輕地按壓載玻片。目的：使細(xì)胞分散開來，有利于觀察。

　　(三)觀察

　　1、先在低倍鏡下找到根尖分生區(qū)細(xì)胞：細(xì)胞呈正方形，排列緊密，有的細(xì)胞正在分裂。

　　2、換高倍鏡下觀察：分裂中期→分裂前、后、末期→分裂間期。(注意各時(shí)期細(xì)胞內(nèi)染色體形態(tài)和分布的特點(diǎn))。其中，處于分裂間期的細(xì)胞數(shù)目最多。

　　考點(diǎn)提示：

　　(1)培養(yǎng)根尖時(shí)，為何要經(jīng)常換水?增加水中的氧氣，防止根進(jìn)行無氧呼吸造成根的腐爛。

　　(2)培養(yǎng)根尖時(shí)，應(yīng)選用老洋蔥還是新洋蔥?為什么?應(yīng)選用舊洋蔥，因?yàn)樾卵笫[尚在休眠，不易生根。

　　(3)為何每條根只能用根尖?取根尖的時(shí)間是何時(shí)?為何?

　　因?yàn)楦�尖分生區(qū)的細(xì)胞能進(jìn)行有絲分裂;上午10時(shí)到下午2時(shí);因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞分裂活躍。

　　(4)解離和壓片的目的分別是什么?壓片時(shí)為何要再加一塊載玻片?解離是為了使細(xì)胞相互分離開來，壓片是為了使細(xì)胞相互分散開來;再加一塊載玻片是為了受力均勻，防止蓋玻片被壓破。

　　(5)若所觀察的組織細(xì)胞大多是破碎而不完整的，其原因是什么?壓片時(shí)用力過大。

　　(6)解離過程中鹽酸的作用是什么?丙酮可代替嗎?分解和溶解細(xì)胞間質(zhì);不能，而硝酸可代替。

　　(7)為何要漂洗?洗去鹽酸便于染色。

　　(8)細(xì)胞中染色最深的結(jié)構(gòu)是什么?染色最深的結(jié)構(gòu)是染色質(zhì)或染色體。

　　(9)若所觀察的細(xì)胞各部分全是紫色，其原因是什么?

　　染液濃度過大或染色時(shí)間過長。

　　(10)為何要找分生區(qū)?分生區(qū)的特點(diǎn)是什么?能用高倍物鏡找分生區(qū)嗎?為什么?

　　因?yàn)樵诟�尖只有分生區(qū)的細(xì)胞能夠進(jìn)行細(xì)胞分裂;分生區(qū)的特點(diǎn)是：細(xì)胞呈正方形，排列緊密，有的細(xì)胞處于分裂狀態(tài);不能用高倍鏡找分生區(qū)，因?yàn)楦弑剁R所觀察的實(shí)際范圍很小，難以發(fā)現(xiàn)分生區(qū)。

　　(11)分生區(qū)細(xì)胞中，什么時(shí)期的細(xì)胞最多?為什么?間期;因?yàn)樵诩?xì)胞周期中，間期時(shí)間最長。

　　(12)所觀察的細(xì)胞能從中期變化到后期嗎?為什么?

　　不能，因?yàn)樗�觀察的細(xì)胞都是停留在某一時(shí)期的死細(xì)胞。

　　(13)觀察洋蔥表皮細(xì)胞能否看到染色體?為什么?不能，因?yàn)檠笫[表皮細(xì)胞一般不分裂。

　　(14)若觀察時(shí)不能看到染色體，其原因是什么?

　　沒有找到分生區(qū)細(xì)胞;沒有找到處于分裂期的細(xì)胞;染液過稀;染色時(shí)間過短。

生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告3

　　實(shí)驗(yàn)日期： 年月 日

　　組長： 組員：

　　一、實(shí)驗(yàn)要求

　　1、練習(xí)使用顯微鏡，學(xué)習(xí)規(guī)范的操作方法。

　　2、能夠獨(dú)立操作顯微鏡。

　　3、能夠?qū)⒉Ｆ瑯?biāo)本移動(dòng)到視野中央，并看到清晰的圖像。

　　二、實(shí)驗(yàn)原理

　　三、材料用具

　　顯微鏡，寫有“上”字的玻片，動(dòng)物、植物玻片標(biāo)本，擦鏡紙，紗布。

　　四、方法與步驟

　　（一）取鏡和安放

　　1、右手握住鏡臂，左手托住鏡座

　　2、把顯微鏡放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，略偏左。安裝好目鏡和物鏡。

　　（二）對(duì)光

　　3、轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔（物鏡的'前端與載物臺(tái)要保持2厘米的距離）。

　　4、把一個(gè)較大的光圈對(duì)準(zhǔn)通光孔。左眼注視目鏡內(nèi)（右眼睜開，便于以后同時(shí)畫圖）。轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡，使光線通過通光孔反射到鏡筒內(nèi)。通過目鏡，以看到白亮的視野。

　�。ㄈ�）觀察

　　5、把所要觀察的玻片標(biāo)本（也可以用印有“e”字的薄紙片制成）放在載物臺(tái)上，用壓片夾壓住，標(biāo)本要正對(duì)通光孔的中心。

　　6、轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩緩下降，直到物鏡接近玻片標(biāo)本為止（眼睛看著物鏡，以免物鏡碰到玻片標(biāo)本）。

　　7、左眼向目鏡內(nèi)看，同時(shí)反方向轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩緩上升，直到看清物像為止。再略微轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，使看到的物像更加清晰。

　　注意事項(xiàng)：

　　1、實(shí)驗(yàn)完畢，把顯微鏡的外表擦拭干凈。轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，把兩個(gè)物鏡偏到峽谷旁。最后把顯微鏡放進(jìn)鏡箱里，

生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告4

　　質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

　　姓名：XXX學(xué)號(hào)：2011001400XX年級(jí)：20xx級(jí)生物基地班 實(shí)驗(yàn)日期：20xx年9月16日—30日組別：6組 同組者：XX

　　一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/strong>

　　1、掌握堿變性提取法提取大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的原理和方法。

　　2、學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進(jìn)行DNA的分離純化的實(shí)驗(yàn)原理。

　　3、學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。

　　4、學(xué)習(xí)并掌握凝膠中DNA的分離純化方法。

　　二、【實(shí)驗(yàn)原理】

　　1、質(zhì)粒DNA的制備方法

　　質(zhì)粒（Plasmid）是獨(dú)立存在于染色體外、能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，但在細(xì)菌細(xì)胞中含量最多。細(xì)菌質(zhì)粒大小介于1～200Kb之間，是應(yīng)用最多的質(zhì)粒類群，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)它們利用宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)構(gòu)合成質(zhì)粒自身的DNA。

　　質(zhì)粒DNA的制備包括3個(gè)步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。主要方法包括：堿裂解法：0。2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于質(zhì)粒大量提取。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

　　2、質(zhì)粒DNA的提取——堿變性提取法

　　在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶pH值不同。在pH值高達(dá)12。0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。因?yàn)樗鼈冊(cè)谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。當(dāng)用pH值4。6的KAc（NaAc）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀

　　DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。

　　3、凝膠電泳進(jìn)行DNA分離純化

　　電泳（electrophoresis）是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA的片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。

　　凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠（ethidium bromide，EB）或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。

　　分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸（5—500bp）的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長度上相差1bp或質(zhì)量上相差0。1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物，由β—D—吡喃半乳糖與3，6—脫水—L—吡喃半乳糖組成，相對(duì)分子質(zhì)量為104—105。瓊脂糖加熱至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點(diǎn)為40—45℃。瓊脂糖凝膠相對(duì)于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大（50至百萬bp），小片段DNA（50—20000bp）最適合在恒定輕度和方向的電場中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對(duì)分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA的片段，進(jìn)一步純化DNA等。

　　瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶有負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率主要取決于6個(gè)因素：樣品DNA分子的`大小、DNA分子的構(gòu)象、瓊脂糖濃度、電泳所用電場、緩沖液和溫度。

　　三、【實(shí)驗(yàn)材料】

　　1、實(shí)驗(yàn)儀器

　　培養(yǎng)皿、接種環(huán)、三角瓶、酒精燈、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、50ml離心管、1。5ml塑料離心管（Eppendorf管）、高速離心機(jī)、漩渦振蕩器、微量移液器、不同型號(hào)槍頭、天平、制膠槽、梳子、電泳儀、吸管、量筒、微波爐、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、試劑瓶、衛(wèi)生紙和記號(hào)筆、手套等。

　　2、實(shí)驗(yàn)試劑

　　LB培養(yǎng)基，抗生素Ap（氨芐青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，預(yù)冷無水乙醇，TAE電泳緩沖液（10×），上樣緩沖液（6×），瓊脂糖，溴化乙錠（EB），DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5。2的醋酸鈉。

　　四、【實(shí)驗(yàn)步驟】

　　1、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)

　　配制LB液體培養(yǎng)基，分裝到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固體培養(yǎng)基；準(zhǔn)備1000ul、200ul、10ul移液槍尖各一盒，1。5ml離心管若干于500ml三角瓶中，50ml離心管2個(gè) ，將上述物品包好連同配好的培養(yǎng)基一同滅菌。

　　2、菌體培養(yǎng)

　　在含有Ap的LB平板上挑取一環(huán)攜帶有質(zhì)粒pUC19的E。coli DH5單菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃振蕩過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加Ap100ul

　�。�100ug/ml），質(zhì)粒pUC19具有Ap抗性基因，使得帶有pUC19的質(zhì)粒得以生長。 過夜培養(yǎng)后菌體量大，雜質(zhì)較多，然后用移液槍吸取過夜培養(yǎng)物2ml轉(zhuǎn)接于50mlLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入Ap250ul，37℃振蕩培養(yǎng)4—6h至對(duì)數(shù)生長期后期，生長速率快，代謝旺盛，酶系活躍，雜質(zhì)少，適合提取質(zhì)粒。

　　3、質(zhì)粒提取

　�。�1）稱量空的50ml離心管的重量為14。331g，然后將三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒?jié)M，液面距管口約1cm，7000rpm離心5分鐘后棄去上清液，收集菌體細(xì)胞。

　�。�2）向離心管中懸滴加入5ml冰預(yù)冷的溶液Ⅰ打散菌體洗滌，用漩渦振蕩器使之充分懸浮后用槍尖吹吸混勻，同步驟（1）離心，棄去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使上清液全部流盡干燥，然后稱重得14。437g，則菌體質(zhì)量為106mg。

　�。�3）洗滌后每100mg菌體應(yīng)加入冰預(yù)冷的溶液Ⅰ1ml，106mg菌體按100mg菌體處理，加入溶液Ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混勻，冰浴5min。溶液Ⅰ中的葡萄糖使

　　溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；維持滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生長。Tris—Cl溶液提供適當(dāng)?shù)膒H。

　　（4） 按比例加入新配制的溶液Ⅱ2ml（與溶液Ⅰ對(duì)應(yīng)），輕加輕搖，冰浴5min。溶液變清亮透明粘稠如蛋清狀。溶液Ⅱ中的NaOH使細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。同時(shí)，強(qiáng)堿性使染色體DNA、質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)變性；SDS為下一步沉淀做鋪墊。

　�。�5）按比例加入冰預(yù)冷的溶液Ⅲ1。5ml（與溶液Ⅰ、Ⅱ?qū)��?yīng)），輕加輕搖，冰浴10min。溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀。沉淀為蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物、細(xì)胞碎片和其他大分子成分。溶液Ⅲ中的HAc中和NaOH，因?yàn)殚L時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷基因組DNA，只要是50－100 kb大小的片斷，就不能再被PDS共沉淀。同時(shí)變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性。反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了沉淀。

　�。�6）12000rpm離心15min，白色沉淀聚集在離心管一側(cè)，用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到另一潔凈的離心管中。然后向上清液中加入1/10體積的3MNaAc混勻，加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。

　�。�7） 以12000rpm離心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，輕輕地覆蓋沉淀，不打散沉淀，洗滌一次。

　�。�8）以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。去掉上清液，將離心管上沉淀部位做好標(biāo)記，將離心管倒置于吸水紙上，干燥5min。粗提取的質(zhì)粒呈淺黃色，隨著水分的減少質(zhì)粒變?yōu)闊o色。所以為了完全溶解質(zhì)粒，要在離心管上標(biāo)記質(zhì)粒所在位置。

　　（9）將DNA沉淀溶于1mlTE緩沖液中，移液槍吹吸助溶，然后將溶解液轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中。TE是pH緩沖液，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對(duì)。同時(shí)含有EDTA是二價(jià)陽離子的螯合劑，抑制DNA酶作用。

　　4、質(zhì)粒純化

　�。�1）Eppendorf管中加入RNase A（純濃度＞50ug/ml），37℃保溫0。5—1h

　�。�2）將上述的溶液平均分配到2個(gè)1。5ml的微量離心管中，每管0。5ml，分別加入與溶液等體積的（500ul）Tris飽和苯酚溶液，振蕩混勻，7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是經(jīng)Tris飽和后的，顯黃色。苯

　　酚加入后，溶液分層，苯酚向下，下層呈淺黃色，上層溶液無色，在中間產(chǎn)生大量白色沉淀，此為變性后的蛋白質(zhì)。

　�。�3）加入等體積的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到到另一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是強(qiáng)的蛋白變性劑，但是苯酚留在質(zhì)粒溶液中會(huì)影響DNA的酶切，它本身易被氧化，會(huì)損傷質(zhì)粒。氯仿也是蛋白變性劑，但是比酚弱，且能溶解質(zhì)粒中的脂類，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫，有利于分層更明顯。此時(shí)溶液中已看不到明顯的白色沉淀，但仍有蛋白質(zhì)的存在。

　　（4）加入等體積的氯仿溶液，振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中，得上清液400ul。

　�。�5）向上清液中加入1/10體積的NaAc混勻，再加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。

　�。�6）以12000rpm，離心15min，棄去上清液，得到DNA沉淀，為白色。

　�。�7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗滌。然后以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。

　�。�8）去掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，室溫干燥。用50ulTE溶解于1管中。

　　5、質(zhì)粒檢測

　�。�1）稱取0。4g的瓊脂糖，置于一錐形瓶中，在三角瓶上標(biāo)好液面位置，加入40ml的1×TAE電泳緩沖液，再加入5—10ml重蒸水，以補(bǔ)充在溶膠過程中損失的水分。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。冷卻至50℃左右，倒入制板槽制板。

　�。�2）待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)加入1×TAE 電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面2—3cm。取1μl加電泳載樣液和3μl質(zhì)粒樣品于小紙片上，用移液槍混勻。

　�。�3）電泳1h，觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動(dòng)。

　　（4） 把膠槽取出，小心滑出膠塊，放進(jìn)EB溶液中進(jìn)行染色，完全浸泡約5min。

　　（5）凝膠成像儀觀察。

　　五、【注意事項(xiàng)】

　�。�1）滴加溶液II時(shí)，要逐滴加入，且要輕加輕搖溶液使之混勻，整體動(dòng)作要快，因?yàn)閺?qiáng)堿在溶液中停留時(shí)間不能過長，否則會(huì)破壞質(zhì)粒DNA。

　　（2）加入溶液III后，生成了大量的絮狀沉淀，溶液III中和強(qiáng)堿使質(zhì)粒復(fù)性，不可劇烈震蕩， 防止染色體DNA斷裂，應(yīng)該上下顛倒離心管，使其混勻。

生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告5