談檳榔十三味丸對抑郁模型大鼠海馬和前額葉皮層信號通路的影響論

　　蒙醫(yī)理論認(rèn)為，“赫依”為抑郁癥發(fā)病的主要病因。在臨床實(shí)踐中，以檳榔十三味丸(高尤-13)為代表的具有調(diào)節(jié)“赫依”功效的蒙藥在抑郁癥治療中取得了較好療效。課題組在以往的實(shí)驗(yàn)中觀察到檳榔十三味丸對小鼠強(qiáng)迫游泳應(yīng)激模型、利血平拮抗模型以及大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型中均呈現(xiàn)明顯的抗抑郁作用。但其分子機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本研究采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS) 結(jié)合孤養(yǎng)方法制備大鼠抑郁模型，測定大鼠海馬和前額葉皮層腺苷酸環(huán)化酶( AC) 活性及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A( PKA) 含量的變化，旨在從AC-cAMP-PKA 信號通路探討檳榔十三味丸抗抑郁作用機(jī)制。

　　1 材料

　　1. 1 動物

　　清潔級Wistar 雄性大鼠60 只，體重180 ～ 200 g，由斯貝福(北京) 實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK( 京)2011-0004。以清潔級大小鼠維持飼料飼養(yǎng)，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，合格證號京飼審(2009) 06166。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物房，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中動物自由攝食和飲水(造模過程中禁食和禁水除外)，室溫20 ～ 22 ℃(冷、熱刺激除外)，相對濕度為60% ～ 70%，光照周期為12 h，7:00—19:00 光照，19:00—7:00 黑暗(晝夜顛倒刺激除外)。

　　1. 2 藥物

　　檳榔十三味丸( 國藥準(zhǔn)字Z15020412，內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，批號120805);鹽酸氟西汀分散片(Patheon France 生產(chǎn)廠，產(chǎn)品批號2076A，分包裝廠為禮來蘇州制藥有限公司，分包裝批號2076AA);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) ( 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20120330);蔗糖( 北京化工廠，批號20110303)。

　　1. 3 試劑與儀器

　　cAMP 放射性同位素免疫試劑盒(北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，批號2013061121); cAMP ( 美國Rapidbio 公司，批號201305122 ); PKA ( 美國Rapidbio 公司，批號201305173);考馬斯亮蘭G-250(南京建成生物工程研究所，批號20130514);Kontro-28Dγ 計(jì)數(shù)儀( 瑞士Kontro 公司);J2-21 低溫離心機(jī)( 美國Beckman 公司);JY99-ⅢB 型超聲器( 寧波新芝科器研究所);5415R 高速離心機(jī)(德國Eppendorf 公司);MultiskanMK3 型酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific 公司);ELx50自動洗板機(jī)( 美國Biotek 公司);電子天平( 常熟市雙杰測試儀器廠);1 /10 萬ES125SM 電子天平( 瑞士precisa 公司);敞箱和電擊足底箱(自制)。

　　2 方法

　　2. 1 分組和給藥Wistar 雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁水24 h，給予1%蔗糖水，測定1 h 內(nèi)的消耗量，根據(jù)蔗糖水消耗量隨機(jī)分為正常對照組、模型組、氟西汀組(3. 3 mg·kg - 1·d - 1 )、檳榔十三味丸低(0. 25 g·kg - 1·d - 1 )、中(0. 5 g·kg - 1·d - 1 )、高(1 g·kg - 1·d - 1)劑量組，每組10 只。正常對照組大鼠每籠5 只飼養(yǎng)，其他各組孤養(yǎng)。造模同時(shí)灌胃給藥，正常對照組、模型組灌胃0. 5% CMC-Na，氟西汀組和檳榔十三味丸各組大鼠分別灌胃西藥氟西汀、蒙藥檳榔十三味丸，各組均按10 mL·kg - 1 體重給藥，每周稱一次體重，連續(xù)給藥28 d。

　　2. 2 制備模型CUMS 結(jié)合孤養(yǎng)模型，參照文獻(xiàn)[3-5]并略加改進(jìn)，模型組、氟西汀組、檳榔十三味丸低、中、高劑量組大鼠共接受28 d 各種不同刺激，包括斷食24 h，斷水24 h，晝夜顛倒24 h，45 ℃熱環(huán)境5 min，4 ℃ 冰水游泳5 min，夾尾1 min，電擊足底(36 V 電壓，每隔1 min 刺激1 次，每次持續(xù)10 s，共30 次)。

　　2. 3 RIA 法測AC 活性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠斷頭處死，剝離全腦，在冰盤上迅速分離出雙側(cè)海馬及前額葉皮層，液氮速凍后- 70 ℃保存待測。將海馬和前額葉皮層組織于4 ℃復(fù)溫，取適量組織樣品，按1∶ 40加入預(yù)冷的Tris-HCl 緩沖液(0. 05 moL·L - 1，pH7. 4)，在冰浴下充分研磨成組織混懸勻漿液。取適量勻漿液，用Bradford 法測定蛋白含量。反應(yīng)總體積為500 μL，其中含有50 mmoL Tris-HCl 緩沖液，8 mmoL茶堿，4 mmoL DTT，1 mmoL EGTA，1 mmoL ATP。加入100 μL 組織勻漿后，30 ℃水浴保溫15 min，于沸水中加熱3 min 終止反應(yīng)，冷卻后于3 000 r·min - 1 離心10 min，取上清液100 μL，Tris-HCl 緩沖液按1∶ 10稀釋測定。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白孔，以反應(yīng)管的cAMP 量減去空白孔的cAMP 量，即為AC 催化凈生成的cAMP量，以pmoL·mg - 1·min - 1表示酶的活性。

　　2. 4 ELISA 法測cAMP 和PKA 含量取海馬和前額葉皮層50 mg 組織樣品，加入0. 5 mL 勻漿液(Tris10 mmoL · L - 1，NaCl 137 mmoL · L - 1，KCl 5mmoL·L - 1，CaCl2 2 mmoL·L - 1，MgCl2 2. 5 mmoL·L - 1，蔗糖0. 25 mmoL·L - 1，PMSF 0. 1 mmoL·L - 1，BSA 0. 1%)，液氮中反復(fù)凍融3 次，每次10 min，然后在冰浴中超聲3 × 4 s，12 000 r·min - 1，離心30min，取上清，用考馬斯亮蘭G-250 蛋白定量后，采用ELISA 法檢測cAMP、PKA 的含量，實(shí)驗(yàn)按說明書操作。

　　2. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以珋x ± s 表示，采用SPSS 19. 0 統(tǒng)計(jì)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析法;P < 0. 05 為差異有顯著性。

　　3 結(jié)果

　　3. 1 檳榔十三味丸對大鼠海馬和前額葉皮層AC活性的影響與正常對照組比較，模型組大鼠海馬、前額葉皮層AC 活性明顯降低( P < 0. 01，P<0. 05);與模型組比較，氟西汀組、檳榔十三味丸中、高劑量組大鼠海馬AC 活性明顯增加( P < 0. 01，P < 0. 05，P < 0. 05)，并且檳榔十三味丸高劑量組大鼠前額葉皮層AC 活性增加尤為顯著(P < 0. 05)。

　　3. 2 檳榔十三味丸對大鼠海馬和前額葉皮層cAMP，PKA 含量的影響與正常對照組比較，模型組大鼠海馬，前額葉皮層cAMP，PKA 含量明顯降低(P < 0. 05，P < 0. 01，P < 0. 01，P < 0. 01);與模型組比較，氟西汀組、檳榔十三味丸中、高劑量組大鼠海馬cAMP 含量明顯升高( P < 0. 05，P < 0. 05，P<0. 05)，氟西汀組、檳榔十三味丸高劑量組大鼠前額葉皮層cAMP 含量明顯升高(P < 0. 01，P < 0. 05)，檳榔十三味丸高劑量組大鼠海馬PKA 含量明顯升高(P < 0. 05)，氟西汀組、檳榔十三味丸中、高劑量組大鼠前額葉皮層PKA 含量明顯升高(P < 0. 05，P < 0. 05，P < 0. 05)。

　　4 討論

　　抑郁癥發(fā)病機(jī)制的信號通路主要有cAMP 通路、鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK) 通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，其中cAMP 信號通路是研究最早、最為深入的信號通路，它在情緒調(diào)節(jié)中起重要作用。G 蛋白耦聯(lián)受體(GPCR) 可與多種神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)肽結(jié)合，其活化導(dǎo)致AC 活性升高，隨后通過升高cAMP 水平而激活PKA，活化的PKA 催化亞基最終使CREB Ser 133 磷酸化，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，從而介導(dǎo)細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，抑郁癥患者及動物海馬、皮層ACcAMP-PKA 信號通路下調(diào)。其臨床研究發(fā)現(xiàn)，有抑郁癥史的自殺患者腦組織中鳥苷酸-5'-亞胺二磷酸或forskolin 誘導(dǎo)的AC 活性明顯降低，cAMP 含量明顯減少。Dwivedi 等進(jìn)一步證實(shí)自殺死亡的抑郁癥患者前額葉皮層中cAMP 和PKA 活性均降低，該學(xué)者在獲得性無助抑郁癥模型大鼠中觀察到，大鼠腦海馬和皮層中的cAMP 和PKA 活性均降低，且大鼠逃避失敗的行為改變與之有關(guān)。Shelton 等研究抑郁癥患者外周血及尸檢腦組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者PKA 活性降低，在特殊的臨床表型尤其是重度抑郁癥和自殺患者中，PKA 活性特別低。cAMP信號通路通過神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)PKA 發(fā)揮抗抑郁治療作用�？挂钟羲幦缏謇�普蘭能激活A(yù)C-cAMPPKA通路，在大鼠和小鼠的多種行為中檢測到其抗抑郁的活性。體外實(shí)驗(yàn)顯示，抗抑郁藥物能引起AC 的活性升高，AC-cAMP 通路作用增強(qiáng)，最終引起靶基因或蛋白表達(dá)的改變。

　　抑郁癥屬蒙醫(yī)“赫依”病范疇，其病理機(jī)制為誘發(fā)疾病的4 個(gè)條件即飲食、起居、氣候、突發(fā)因素等引起“赫依”病變，當(dāng)“赫依”偏盛、偏衰或紊亂，竄行至心臟阻滯白脈，影響到白脈之海大腦而引起，因此蒙醫(yī)臨床多從“赫依”論治。檳榔十三味丸中檳榔具有調(diào)節(jié)“赫依”功效，對“赫依”引起的眩暈、心悸等有治療作用;沉香、紫硇砂、廣棗、草烏、木香、當(dāng)歸、葶藶子等具有調(diào)節(jié)“赫依”、益心、止痛和治氣血紊亂之效;酌加的三熱藥干姜、蓽撥、胡椒亦能補(bǔ)益胃火和改善消化;諸藥合用共奏調(diào)節(jié)“赫依”，安神止痛之功。

　　前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，檳榔十三味丸可明顯改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動以及糖水消耗量降低，并抑制慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠HPA 軸功能亢進(jìn)。海馬和額葉皮層是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)，與行為、認(rèn)知等神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)以海馬和前額葉皮層的受體后信號通路作為觀察對象，研究檳榔十三味丸對抑郁大鼠不同腦區(qū)AC 活性，cAMP 和PKA 含量的影響。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬、前額葉皮層等腦區(qū)的AC 活性降低，cAMP 和PKA 含量降低，提示慢性應(yīng)激可能使AC-cAMP-PKA 信號通路下調(diào)，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。給予氟西汀、檳榔十三味丸(0. 5 或1 g·kg - 1·d - 1 ) 可以拮抗這一作用，使大鼠海馬、前額葉皮層AC 活性升高，cAMP 和PKA 含量增加，AC-cAMP-PKA 信號通__路活性增強(qiáng)。而氟西汀組海馬PKA 含量和前額葉皮層AC 活性與模型組相比無顯著差異，這可能與給藥劑量、取標(biāo)本時(shí)間、樣本量、檢測方法等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，檳榔十三味丸(0. 5 或1 g·kg - 1·d - 1 ) 治療作用與氟西汀相當(dāng)，而高劑量檳榔十三味丸(1 g·kg - 1·d - 1 ) 在改善海馬PKA 含量和前額葉皮層AC 活性方面作用更顯著。由此可見，檳榔十三味丸可能是通過調(diào)節(jié)受體后ACcAMP-PKA 信號通路而發(fā)揮抗抑郁作用。其可能的.機(jī)制為檳榔十三味丸調(diào)節(jié)抑郁模型大鼠皮質(zhì)酮的升高，提高海馬、前額葉皮層等腦區(qū)5-HT 含量，進(jìn)而升高5-羥色胺1A 受體(5-HT1AR) 的結(jié)合力，促進(jìn)5-HT1AR 與Gas 蛋白偶聯(lián)，上調(diào)G 蛋白-ACcAMP信號通路功能。Dwivedi 等的研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)酮可影響PKA 的催化活性和與[3H]cAMP 的結(jié)合并改變大鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)PKARⅠα，RⅡβ 和Cβ亞基的表達(dá)，提示慢性應(yīng)激可能通過HPA 軸影響PKA 的表達(dá)和催化活性。故檳榔十三味丸也可能通過調(diào)節(jié)抑郁模型大鼠HPA 軸功能而影響PKA活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)AC-cAMP-PKA 活性。值得提出的是，細(xì)胞內(nèi)信號通路是一個(gè)十分復(fù)雜的系統(tǒng)，不但受各種外界因素的調(diào)控，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)各信號系統(tǒng)間也存在相互協(xié)調(diào)作用。因此，檳榔十三味丸對其他信號通路的干預(yù)作用如何，這些信號通路間的相互作用和相互聯(lián)系又如何等值得進(jìn)一步深入研究。

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