研究3,5,2,4菜聶腔查爾酮對高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的影響論文
痛風(fēng)(gout)是由于體內(nèi)尿酸結(jié)晶沉積到軟組織，引發(fā)急、慢性炎癥和組織損傷，出現(xiàn)臨床癥狀和體征的一組臨床綜合征。通常認(rèn)為高尿酸血癥是痛風(fēng)最重要的生化基礎(chǔ)，據(jù)統(tǒng)計有5% ～12%的高尿酸血癥最終可發(fā)展為痛風(fēng)。任何原因引起尿酸生成增多和(或)排泄減少均可導(dǎo)致高尿酸血癥，其中尿酸排泄減少約占原發(fā)性高尿酸血癥患者的90%。腎臟在尿酸的排泄中占有重要地位，體內(nèi)2/3的尿酸由腎臟排泄，經(jīng)過腎小球濾過、腎小管重吸收、再分泌和再吸收而排出體外，其中腎小管對尿酸的重吸收是影響血尿酸水平的主要環(huán)節(jié)。近年的研究認(rèn)為腎臟的尿酸轉(zhuǎn)運體URAT1/SLC22A12GLUT9/SLC2A9參與了尿酸的重吸收。
3，5，2′，4′菜聶腔查爾酮(C15H12O5，P40)(Fig1)是中國科學(xué)院昆明植物所朱華結(jié)研究員課題組以3，5捕羥基苯甲酸為原料合成的查爾酮類化合物。該類化合物存在于甘草、啤酒花、鐮形棘豆等藥用植物中，由于其分子結(jié)構(gòu)有較大柔性，能與不同的受體結(jié)合，具有廣泛的生物活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)P40具有較強的降尿酸作用，其機制與抑制黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤脫氫酶(XOD/XDH)的活性有關(guān)。然而，P40的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于上市的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇和非布索坦，很可能存在新的作用機制和靶點。鑒于腎臟在尿酸排泄中的重要作用，本研究擬從腎臟尿酸排泄角度探討P40的降尿酸作用及其分子機制，為闡明P40的作用機制提供科學(xué)依據(jù)。
1.材料
1.1 實驗動物
昆明種小鼠，♂，體質(zhì)量18～22g，由四川成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：[SCXK(川)2011-24]，自由飲食。
1.2 主要材料與試劑
3，5，2’，4’菜聶腔查爾酮：由中國科學(xué)院昆明植物所朱華結(jié)研究員課題組合成并提供，分子質(zhì)量為272.25;苯溴馬�。旱聡章笏帍S生產(chǎn)，由昆山龍燈瑞迪制藥有限公司分裝;尿酸：購于Sigma公司;尿酸測定試劑盒：南京建成生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);URAT1抗體：購于Protein公司;GLUT9抗體：購于Sigma公司;β瞐ctin、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記：Abmart公司。
1.3 儀器
全波長酶標(biāo)儀：MolecularDevices公司，型號：SPECTRAMAX190;電熱恒溫水浴箱：北京長風(fēng)公司，型號：HH·W21;高速冷凍離心機：HERM睱E公司，型號：Z300K;酶標(biāo)板：美國Costar公司。
2 方法
2.1 動物分組及給藥
選取標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量(18～22g)♂昆明小鼠60只，隨機分為正常組、高尿酸血癥模型組、P40(20、40、80mg·kg-1)劑量組、苯溴馬隆125mg·kg-1組，各給藥組共灌胃給藥5次，每天兩次;腹腔注射尿酸150mg·kg-13次誘導(dǎo)形成高尿酸血癥小鼠，正常對照組則注射等體積溶媒。末次腹腔注射尿酸前40min灌胃給予各受試藥物，給藥后1h眶靜脈取血，3000r·min-1離心10min，取血清;斷頸處死小鼠，迅速分離肝臟和腎臟，液氮凍存后于-80℃保存?zhèn)錅y。磷鎢酸法測定小鼠血尿酸水平和肝尿酸含量。
2.2 RT睵CR檢測腎臟URAT1、GLUT9基因表達水平
小鼠URAT1、GLUT9引物采用DNAMAN6.0設(shè)計(Tab1)，經(jīng)PubMedBLAST驗證后，由上海生工生物工程有限公司合成。每組隨機選取4例凍存的小鼠腎臟，提取總RNA后，ND1000定量，并進行逆轉(zhuǎn)錄，隨后進行擴增。URAT1的擴增條件為：94℃ 2min、94℃ 30s、58℃ 35s、72℃ 45s、72℃ 10min、4℃ 30cycles，GLUT9的擴增條件為：94℃ 2min、94℃ 30s、57.7℃35s、72℃ 45s、72℃ 10min、4℃ 30cycles。電泳后的瓊脂糖凝膠用BIO睷AD凝膠成像系統(tǒng)進行凝膠成像，并對條帶進行灰度比值分析。
2.3 Westernblot檢測腎臟URAT1、GLUT9蛋白的表達水平
取凍存的小鼠腎臟，每組4例，組織裂解液提取小鼠腎臟組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量。蛋白與上樣緩沖液的比例為1∶4，混勻后95℃10min煮沸變性，進行SDS睵AGE電泳;濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜;脫脂奶粉37℃搖床封閉膜2h;4℃過夜孵育URAT1、GLUT9一抗(1∶1000)、β瞐ctin(1∶1000);TBST洗膜，室溫?fù)u床孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)1h;TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光。BIO睷AD系統(tǒng)成像，URAT1、GLUT9蛋白的相對表達量用URAT1、GLUT9與β瞐ctin的光密度比值進行計算。
2.4 統(tǒng)計學(xué)分析
數(shù)據(jù)用珋x±s表示，采用單因素方差分析，用SPSS170軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。
3 結(jié)果
3.1 P40對尿酸誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平和肝尿酸含量的影響 與正常組比較，模型組小鼠血尿酸水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<001)，提示模型復(fù)制成功;灌胃給予P40后，P40(40、80mg·kg-1)組及苯溴馬隆組血尿酸水平明顯下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<005)，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系;與正常組比較，模型組及各給藥組肝尿酸水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<001);各給藥組的肝尿酸水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>005。
3.2 P40對尿酸誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠腎臟URAT1基因、蛋白表達水平的影響 由Fig2可看出小鼠腎臟URAT1基因表達水平無變化。模型組URAT1蛋白表達上調(diào)，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;P40各系列給藥組UART1蛋白表達均有下調(diào)趨勢，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;苯溴馬隆組下調(diào)URAT1蛋白表達，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
3.3 P40對尿酸誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9基因、蛋白表達水平的影響 由Fig3可見，模型組GLUT9基因表達有上調(diào)趨勢，但與正常組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義;P40各給藥組以及苯溴馬隆組其基因表達有下調(diào)趨勢，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組GLUT9的蛋白表達上調(diào)，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;P4040、80mg·kg-1給藥組GLUT9蛋白表達下調(diào)，并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;而P4020mg·kg-1給藥組有下調(diào)GLUT9蛋白表達的趨勢，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;苯溴馬隆組對其蛋白表達沒有影響。
4 討論
尿酸是人類嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，由次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤，再在該酶的作用下進一步生成尿酸，而肝臟作為黃嘌呤氧化酶的高表達器官，是尿酸生成的主要場所，對機體尿酸的穩(wěn)態(tài)起著重要的調(diào)節(jié)作用。體內(nèi)生成70%的尿酸經(jīng)由腎臟排泄。因此，增加體內(nèi)尿酸、尿酸前體(次黃嘌呤、黃嘌呤)的量或抑制腎臟尿酸的排泄均可引起血尿酸水平的增高導(dǎo)致高尿酸血癥。本研究采用直接補充大劑量的外源性尿酸誘導(dǎo)形成高尿酸血癥小鼠，在不影響小鼠自身尿酸生成的前提下，觀察P40對尿酸排泄的影響。結(jié)果表明P40劑量依賴性地降低了高尿酸血癥小鼠的血尿酸水平，與促尿酸排泄藥苯溴馬隆相似，提示P40具有促進尿酸排泄的作用。此外，在本實驗條件下，模型組及各用藥組的肝臟尿酸含量均低于正常組，提示大劑量的外源性尿酸進入機體后，有可能抑制了肝尿酸的生成。
研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞頂端膜和基底膜上的多個轉(zhuǎn)運蛋白與尿酸的重吸收和分泌有關(guān)，其中尿酸轉(zhuǎn)運體URAT1/SLC22A12和GLUT9/SLC2A9參與了尿酸的重吸收。URAT1和GLUT9分別表達于腎近端小管上皮細(xì)胞的頂端膜與基底膜，URAT1將尿酸從小管液中攝入小管細(xì)胞內(nèi)，再經(jīng)GLUT9泵出小管細(xì)胞基底膜，進入細(xì)胞間質(zhì)和外周血管。URAT1基因突變將導(dǎo)致轉(zhuǎn)運體功能減退或喪失而表現(xiàn)出腎性低尿酸血癥，提示URAT1是影響血尿酸水平的`一個重要的轉(zhuǎn)運蛋白。苯溴馬隆即是以URAT1為靶點的促尿酸排泄藥，本實驗條件下也觀察到苯溴馬隆干預(yù)了該轉(zhuǎn)運體的蛋白表達，然而，P40則對高尿酸血癥小鼠腎臟URAT1的基因、蛋白表達均無太大影響，初步提示P40促尿酸排泄作用的靶點并非URAT1。
GLUT9主要表達于腎臟和肝臟，雖然是葡萄糖轉(zhuǎn)運體家族成員之一，與GLUTs有相似的氨基酸序列，然而，其轉(zhuǎn)運葡萄糖和果糖的能力較低。新近研究顯示GLUT9與尿酸的轉(zhuǎn)運密切相關(guān)，是一種高能尿酸轉(zhuǎn)運體。該轉(zhuǎn)運體以電壓依賴的方式將尿酸從小管細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞間質(zhì)和外周血管中，它的轉(zhuǎn)運功能并不依賴于Na+，而當(dāng)細(xì)胞外K+濃度升高時，其轉(zhuǎn)運功能增強，故又稱為電勢驅(qū)動尿酸轉(zhuǎn)運蛋白1(voltagedrivenuratetransporter1，URATv1)。本實驗結(jié)果顯示P40明顯降低高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9蛋白的表達，而對GLUT9的mR睳A水平僅有下調(diào)趨勢，并未達到顯著統(tǒng)計學(xué)意義，說明P40主要干預(yù)了GLUT9蛋白的合成，而對基因的轉(zhuǎn)錄過程影響不明顯。此外，本研究顯示苯溴馬隆對GLUT9的mRNA和蛋白表達均無明顯影響，提示P40促進尿酸排泄的機制與苯溴馬隆不同，可能是通過下調(diào)GLUT9蛋白的表達，減少尿酸的重吸收而起到降尿酸的作用。
綜上所述，P40具有促進高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的作用，其機制與下調(diào)GLUT9蛋白的表達有關(guān)。
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