談百合固金湯四逆湯含藥血清對TLR2和TLR4比值的影響論文
本項研究所用四逆湯為《傷寒論》之“經(jīng)方”，百合固金湯典出明代《慎齋遺書》。此兩方之立方均據(jù)張仲景之“六經(jīng)”辯證。且推其早年之“回陽救逆”和“滋陰養(yǎng)肺”功效均與感染性疾病有不解之緣。此兩方之藥理又恰為中醫(yī)“養(yǎng)陰”“回陽”治則之代表。故選此兩方為對照，觀察機體感染發(fā)生過程中，兩者對固有免疫調(diào)節(jié)之異同，極有可能揭示“養(yǎng)陰”“回陽”兩種治則對免疫細胞之實際作用。在基于經(jīng)驗的中醫(yī)臨床治則和基于實證的現(xiàn)代免疫藥理之間牽起一線“姻緣”。
Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是表達于巨噬細胞表面的一類模式識別受體(pattern recognition receptor， PRR)，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)TLR2與TLR4在炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中并非起協(xié)同作用，研究發(fā)現(xiàn)TLR2的表達能抑制TLR4信號的過度激活。故推測TLR2和TLR4可能是“養(yǎng)陰”“回陽”兩種治則對免疫細胞，尤其對固有免疫細胞的功能產(chǎn)生調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用靶標。TLR2和TLR4是識別結(jié)核分枝桿菌的主要模式識別受體，此文選取臨床治療結(jié)核感染的百合固金湯和對感染性休克起治療作用的四逆湯為例，觀察兩方對RAW264.7細胞表面TLR2和TLR4比值是否存在影響，作為深入探討“養(yǎng)陰”“回陽”治則在抗感染作用研究中的引玉之磚。
1 材料與方法
1.1 動物、細胞及細菌
體重(2.0±0.2)kg，健康雄性新西蘭大白兔10只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。小鼠巨噬細胞RAW264.7，購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。結(jié)核分枝桿菌株H37Ra，引自上海復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所。
1.2 主要試劑
百合固金湯和四逆湯個飲片，均購自上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司;慶大霉素注射液，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院;DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶，均購自Gibco公司;7H9、7H10培養(yǎng)基，均購自BD Difco公司;TRIzol試劑， 購自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×PCR Mixture， 購自TAKARA 公司;PCR 引物，由上海生工生物工程有限公司合成;FITC標記anti-mouse CD282(TLR2)熒光抗體與PE標記anti-mouse CD284(TLR4)熒光抗體及其同型對照，均購自于Biolegend公司;PCR-Fluorescent Probing試劑盒，購自凱杰生物工程(深圳)有限公司。
1.3 細菌培養(yǎng)
用含10%ADC的7H9培養(yǎng)液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周觀察1次，一般培養(yǎng)1～2周可見瓶底有細菌顆粒生長，(10～15)d達對數(shù)生長期。取對數(shù)生長期細菌用不含血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為1×107 個/ml。
1.4 細胞培養(yǎng)
小鼠巨噬細胞RAW264.7按常規(guī)方法用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，調(diào)整細胞密度為1×106 個/ml，以每孔2ml鋪于6孔板中，24h后用于后續(xù)實驗。
1.5 含藥血清的制備及細胞干預(yù)
各方按臨床用藥量乘以動物的體表面積系數(shù)求得相應(yīng)給藥量，經(jīng)常規(guī)方法煎煮，濃縮至10倍劑量置4℃冰箱備用。10只新西蘭大白兔隨機分為空白對照組(control，4只)、百合固金湯組(BGD，3只)和四逆湯組(SND，3只)。各用藥組按10ml/kg灌服相應(yīng)藥液，對照組灌服等量生理鹽水。每日1次，連續(xù)4d。于最后一次灌胃1h后心臟采血(最后一次給藥前禁食不禁水12h)分離血清，同組動物血清混勻，56℃滅活30min后，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝置-80℃冰箱備用。將RAW264.7細胞密度調(diào)整為1×106 個/ml，每組設(shè)3復(fù)孔，2ml/孔鋪于6孔板常規(guī)培養(yǎng)24h后，各用藥組加入含10%相應(yīng)含藥血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，對照組加入含10%空白兔血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，24h后檢測各組TLR2、TLR4的mRNA 及蛋白表達量。
1.6 感染模型建立及藥物干預(yù)
模型組用含10%空白兔血清的培養(yǎng)液重懸沉淀細胞，分別作用24h和48h后進行相關(guān)指標的檢測。各含藥血清組及對照組按照細胞∶細菌為1∶10的比例加入用10%相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)液重懸的細菌，密度為1×107 個/ml的Mtb H37Ra，2ml/孔。
1.7 指標測定
TLR2與TLR4的mRNA表達以RT-QPCR 的方法檢測， 以GAPDH 作為內(nèi)參，結(jié)果用2-△△Ct表示。TLR2與TLR4蛋白表達水平的檢測，以FACS檢測細胞表面TLR2與TLR4的表達百分比。細胞吞噬、殺菌能力測定，以QPCR檢測巨噬細胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌DNA含量： 按照凱杰生物工程(深圳)有限公司的PCRFluorescent Probing試劑盒說明做標準曲線后計算各樣本中的結(jié)核分枝桿菌拷貝數(shù)。
1.8 統(tǒng)計學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析，二組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 百合固金湯和四逆湯
含藥血清對TLR2與TLR4 mRNA表達的影響及其比值的改變 表1結(jié)果顯示，與對照組相比，百合組RAW264.7細胞TLR2mRNA的表達沒有明顯差異(P>0.05)，但TLR4mRNA 水平較之上升明顯(P<0.05)，TLR2/TLR4 下調(diào)明顯(P <0.05); 四逆組RAW264.7細胞TLR2及TLR4mRNA的表達都明顯上升(P<0.05)，但TLR2/TLR4較之無明顯差異。兩用藥組之間比較TLR2、TLR4及TLR2/TLR4的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
2.2 百合固金湯和四逆湯
含藥血清對TLR2與TLR4蛋白表達的影響及其比值的改變 圖1、表2結(jié)果表明，與對照組相比，兩用藥組RAW264.7細胞表面TLR2和TLR4表達百分率均有上升，TLR2增加尤為明顯(P<0.05)，兩用藥組之間相比可見百合組TLR2 百分數(shù)較四逆組低(P <0.05)，但TLR4百分數(shù)較四逆組高(P<0.05)。表中結(jié)果顯示，與對照組相比，百合組tlr2 p="">0.05)，而四逆組TLR2/TLR4比值明顯高于空白組(P<0.05)，兩用藥組相比，四逆組TLR2/TLR4比值較百合組增長更明顯(P<0.05)。
2.3 百合固金湯和四逆湯含
藥血清對巨噬細胞吞噬殺菌能力的影響 QPCR法檢測巨噬細胞內(nèi)結(jié)核桿菌DNA的表達水平，以細菌數(shù)量取lg10作統(tǒng)計處理，圖2顯示Mtb H37Ra與RAW264.7細胞作用24h和48hQPCR法檢測到的細菌含量差異，24h結(jié)果顯示三組之間無明顯差異，而48h的結(jié)果顯示百合組的細菌含量較其他兩組明顯減少(P<0.05)。各用藥組24h和48h的前后比較發(fā)現(xiàn)百合組較之對照組和四逆組其殺菌能力明顯提高(P<0.05)，提示百合固金湯抗癆作用可能與調(diào)節(jié)TLR2/TLR4比值相關(guān)。
3 討論
TLR是一種重要的PRR，能夠識別多種病原相關(guān)分子模式(PAMP)，TLR的研究已涉及到腫瘤，自身免疫性疾病，自身代謝性疾病及各種感染性疾病等多個領(lǐng)域。在目前發(fā)現(xiàn)的10種人類TLR中，TLR2與TLR4是其中研究得較為清楚的兩種。TLR2可廣泛識別多種病原相關(guān)分子模式，包括革蘭陽性菌的磷壁酸和肽聚糖、分枝桿菌胞壁組分、細菌脂蛋白、鉤端螺旋體的.LPS、酵母菌細胞壁等等，TLR4是第一個在哺乳動物發(fā)現(xiàn)的TLR，可以識別LPS、磷壁酸、熱休克蛋白、呼吸道合胞病毒F蛋白等配體。以往許多研究顯示TLR2、TLR4能夠啟動機體的固有免疫應(yīng)答，對病原體發(fā)揮殺滅清除作用。通常認為TLR2、TLR4都可經(jīng)MyD88(myeloid differentiation factor 88)途徑調(diào)控炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。但也不排除兩者都存在有非MyD88依賴的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。盡管多數(shù)文獻認為TLR2與TLR4在炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起協(xié)同作用，但Finamore等對乳酸桿菌的研究時發(fā)現(xiàn)，TLR2在抑制TLR4信號過度激活的過程中有重要作用，可能成為抗炎治療的新的靶點。而早在2012年，國內(nèi)就有過類似的報道，北京解放軍第306醫(yī)院消化內(nèi)科曹艷菊用雙歧三聯(lián)活菌治療急性結(jié)腸炎模型大鼠，隨后檢測TLR2、TLR4及NF-κB的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益生菌組TLR2表達較模型組明顯增加，而TLR4表達明顯下降，NF-κB活性較模型組也明顯降低，提示益生菌可能通過進一步增加TLR2 的表達，并抑制TLR4的表達，進而調(diào)控NF-κB的活性，以緩解腸道炎癥。這些發(fā)現(xiàn)與本實驗所提供的研究結(jié)果似有類似之處，提示某些藥物或微生物確實可以誘導(dǎo)形成TLR2、TLR4表達的拮抗局面，并由此而影響感染與炎癥的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。
在本項研究的結(jié)果中，似乎可提示以四逆湯(附子、干姜、甘草)為代表的“回陽救逆”治則與以百合固金湯(百合、玄參、白芍、生地、熟地等)為代表的“養(yǎng)陰”治則在對感染過程中識別病原體的PRR表達類型可產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)格局，如本項研究所顯示。或許百合固金湯對TLR4表達增高的調(diào)節(jié)作用與其治療結(jié)核病的臨床功效有著內(nèi)在聯(lián)系(啟動炎癥通路，清除細胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌);而四逆湯之增高TLR2表達的作用也是和其治療感染性休克的臨床作用不可分離(有可能通過TLR2/TLR4的拮抗作用，降低了TLR4對LPS的反應(yīng)敏感性)。盡管這樣的推論與猜測還需要更多深入的研究去加以驗證，但目前的發(fā)現(xiàn)無疑是一個新的開端。這為中醫(yī)陰陽理論在感染性疾病的實踐應(yīng)用中所取得的卓越療效提供了可能的科學(xué)解釋。
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