談乳果糖對便秘小鼠結(jié)腸水通道蛋白4表達(dá)的影響的論文

　　便秘是消化道常見的慢性病癥，隨著飲食結(jié)構(gòu)變化及精神、心理因素的影響，其發(fā)病呈上升趨勢，嚴(yán)重影響著人類的身心健康，水代謝紊亂為其主要的發(fā)病環(huán)節(jié)。水通道蛋白(aquaporins，AQP)是特異性轉(zhuǎn)運水的蛋白家族，參與機(jī)體水的分泌、吸收及細(xì)胞內(nèi)外水平衡的調(diào)節(jié)，已有研究發(fā)現(xiàn)水通道蛋白3、4、8 等存在于結(jié)腸，與結(jié)腸水吸收密切相關(guān)。滲透性瀉藥，通過提高腸腔內(nèi)滲透壓，使糞便含水量增加，緩解便秘癥狀，但其具體作用機(jī)制及和水通道蛋白之間的聯(lián)系尚不明確，本研究通過構(gòu)建小鼠便秘模型，應(yīng)用免疫組化和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(yīng)(RT-PCR)方法研究乳果糖對便秘小鼠結(jié)腸AQP4 表達(dá)情況的影響，探討乳果糖和AQP4 之間的關(guān)系，為臨床便秘治療提供理論依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗動物及分組：健康昆明雄性小鼠30 只，體質(zhì)量(20.0±2.0)g，隨機(jī)分為陰性對照組、便秘模型組、乳果糖治療組。

　　1.2 便秘模型制備、成功標(biāo)準(zhǔn)、取材：

　�、倌Ｐ椭苽洌簠⒄瘴墨I(xiàn)，便秘組給予50 mg/kg 的復(fù)方地芬諾酯灌胃，陰性對照組給予等量的蒸餾水灌胃。灌胃后動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲食進(jìn)水。便秘模型造模成功后，將模型隨機(jī)分為乳果糖治療組和便秘模型組，治療組給予乳果糖(0.6 ml/20 g)灌胃，模型對照組和陰性對照組給予等量的蒸餾水灌胃。

　　② 模型判定標(biāo)準(zhǔn)：觀察陰性對照組與便秘模型組小鼠首粒排便時間、12 h內(nèi)排便粒數(shù)和排便重量數(shù)值比值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，便秘模型制備成功。

　�、廴〔模簩嶒炐∈笠运�合氯醛腹腔麻醉并處死，迅速取升、降結(jié)腸組織各1 塊，置于-85 ℃冰箱，供RT-PCR 使用。

　　1.3 RT-PCR 測定結(jié)腸AQP4mRNA 表達(dá)：

　　選用β-肌動蛋白基因為內(nèi)參照引物基因，反應(yīng)中所用的上游引物為：5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGCC-3′，下游引物為5′-CAGGTCCAGACGACGCAGGATGGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為：270 bp;AQP4(Genbankaccession number U14007)上游引物為：5′-GGGTTGGACCAATCATAGGCGCT-3′(701-723)，下游引物為：5′-GCAGGAAATCTGAGGCCAGTTCTAGG-3 (1030-1005)，擴(kuò)增產(chǎn)物為：330 bp。cDNA 序列查自基因庫，2 對引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)步驟及反應(yīng)體系見MBIFermentas 公司試劑盒說明，AQP4 反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，62℃ 30 s，72 ℃30 s，共36 個循環(huán);β-肌動蛋白反應(yīng)條件為94℃ 20 s，58 ℃ 30 s。72 ℃ 30 s，共35 個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳及半定量分析：取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，置1%瓊脂糖凝膠中，TBE 電泳緩沖液中4 V/cm 電壓電泳60 min，用GDS7500圖像分析系統(tǒng)(英國UVP 公司)進(jìn)行密度掃描定量，以AQP4基因與β-肌動蛋白比值表示AQP4 mRNA 的相對表達(dá)量。

　　1.4 統(tǒng)計學(xué)處理：

　　計量資料以x±s 表示，所有數(shù)據(jù)均用SPSS17.0 軟件分析。AQP4 表達(dá)量的比較采用析因設(shè)計的方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 小鼠便秘模型及藥物干預(yù)結(jié)果：

　　20 只便秘模型(包括乳果糖治療組用藥前)小鼠與陰性對照組比較，首粒排便時間明顯延長，12 h 內(nèi)排便粒數(shù)、排便質(zhì)量明顯減少(P<0.01)，便秘模型制備成功。乳果糖治療組(用藥后)與陰性對照組以上指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，與便秘模型組比較上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明用藥后便秘癥狀改善，藥物治療有效。

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