分析榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠造成的影響論文
骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)功能與結(jié)構(gòu)退行性疾病，屬于臨床常見病，目前尚缺乏有效的根治措施，作為非手術(shù)療法的中醫(yī)藥在治療慢性退行性疾病過程中顯示出獨(dú)特的療效而日益受到人們的重視。OA 屬于中醫(yī)“痹證”的范疇，多因腎氣虧虛、關(guān)節(jié)失養(yǎng)，復(fù)受風(fēng)寒濕邪，氣血痹阻，經(jīng)絡(luò)不暢而發(fā)，治則為補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、勝濕止痛。在上述中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下形成的榮骨定痛膏在臨床上取得了較好的療效。本研究通過復(fù)制OA大鼠模型，考察榮骨定痛膏對(duì)OA 大鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能、關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性細(xì)胞以及對(duì)血清白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的影響，探討榮骨定痛膏防治OA 的作用及機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 藥物與試劑
榮骨定痛膏(靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院，批號(hào)：20140610，每毫升軟膏劑含原生藥1.5 g);鹽酸氨基葡萄糖膠囊(浙江誠意藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20130603，規(guī)格：240 mg);木瓜蛋白酶(美國Sigma 公司，批號(hào)118K1461);IL-1β(批號(hào)：20140608)、IL-6(批號(hào)：20140608)與TNF-α(批號(hào)：20140501)試劑盒均購于北京華英生物技術(shù)研究所。
1.2 動(dòng)物與分組
SPF 級(jí)，♂，SD 大鼠，體質(zhì)量180~220 g，質(zhì)量合格證號(hào)：62001000000033，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001。48 只SD 大鼠，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，氨基葡萄糖組(90 mg·kg?1)，榮骨定痛膏高、中、低劑量組(120，60，30 mg·d?1)。
1.3 儀器
TGL-16G 高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);N-5600PC 型METASH 可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);HH-S 型恒溫水浴鍋(金壇市正基儀器有限公司);BS1103 電子天平(北京賽多里斯有限公司)。
1.4 造模與給藥
各組大鼠膝關(guān)節(jié)周圍及上下0.5 cm 處皮膚脫毛，參照相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法[3-4]，在造模的第1，3，7天，將4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液50 μL 注入大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。造模的同時(shí)給藥，榮骨定痛膏高、中、低劑量組在大鼠膝關(guān)節(jié)及上下0.5 cm 處涂抹不同濃度(1.500，0.750，0.375 g·mL?1)的榮骨定痛膏40 μL(即60，30，15 mg)，氨基葡萄糖組灌胃0.9%氨基葡萄糖5 mL·kg?1(即45 mg·kg?1)，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組膝關(guān)節(jié)涂抹蒸餾水，2 次·d?1，連續(xù)5 周。
1.5 指標(biāo)檢測
末次涂藥2 h，麻醉大鼠后測量被動(dòng)膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度;之后采血，測定IL-6、IL-1β 與TNF-α 的水平;取血后處死大鼠，抽提關(guān)節(jié)腔灌洗液，離心，取其沉淀混懸液制片，在光鏡下分類計(jì)數(shù)炎性細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行半定量分析;刮取關(guān)節(jié)面上的滑膜組織，測定關(guān)節(jié)滑膜厚度。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x ? s表示，組間比較采用單因素方差分析，半定量資料采用Ridit 分析，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 榮骨定痛膏對(duì)OA 大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍及關(guān)節(jié)滑膜厚度的影響與正常對(duì)照組比較，大鼠膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶35 d 后，膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)范圍明顯縮窄，關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度明顯增加(P<0.01);與模型對(duì)照組比較，經(jīng)榮骨定痛膏防治后，膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)范圍擴(kuò)大，關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度明顯減小(P<0.05 或0.01);與榮骨定痛膏低劑量組比較，榮骨定痛膏高劑量組的防治作用更強(qiáng)(P<0.05)，顯示出一定的量效關(guān)系。
2.2 榮骨定痛膏對(duì)OA 大鼠關(guān)節(jié)液中炎性細(xì)胞的影響對(duì)關(guān)節(jié)灌洗沉淀混懸液中的炎性細(xì)胞數(shù)目分級(jí)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，注射木瓜蛋白酶后關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性細(xì)胞明顯增加(P<0.01);與模型對(duì)照組比較，經(jīng)榮骨定痛膏治療后，關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性細(xì)胞數(shù)有所減少，其中榮骨定痛膏高劑量組差異有顯著性(P<0.05)。
2.3 榮骨定痛膏對(duì)OA 大鼠模型血清細(xì)胞因子的影響與正常對(duì)照組比較，OA 模型大鼠血清IL-1β、IL-6 與TNF-α 均明顯升高(P<0.01);與模型對(duì)照組比較，經(jīng)榮骨定痛膏防治后，IL-1β、IL-6 與TNF-α均不同程度地下降(P<0.05 或0.01)。
3 討論
OA 發(fā)病率隨年齡的增長而升高，隨著我國社會(huì)人口結(jié)構(gòu)的迅速老齡化，該病發(fā)病率逐年增加。該病不僅是公共衛(wèi)生問題，也成為社會(huì)問題，日益引起人們的重視。OA 的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，但其基本病理變化為關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變與關(guān)節(jié)的增生性改變(特別是軟骨周圍及滑膜處)。目前臨床上尚缺乏有效的根治措施，手術(shù)治療又缺乏確切有效的臨床治療方案，作為非手術(shù)療法的中醫(yī)藥治療日益受到人們的`重視。
在OA 的發(fā)病過程中，炎癥細(xì)胞及促炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 等是參與OA 炎癥反應(yīng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)滑膜炎癥的發(fā)展與軟骨基質(zhì)的破壞具有重要作用，也是OA 治療的潛在靶點(diǎn)。IL-1 是最早出現(xiàn)也是最重要的OA 促炎因子，主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，亦可由軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞產(chǎn)生。IL-1 有IL-1α 與IL-1β 2 種亞型，其中IL-1β 是IL-1 的主要成分，成熟的IL-1β 是由IL-1 轉(zhuǎn)換酶裂解IL-1β 前體而來，是一種強(qiáng)有力的致痛炎癥因子，在急慢性炎癥中引發(fā)全身性癥狀如發(fā)熱，在局部則引起組織炎癥和破壞性病變。在正常關(guān)節(jié)中IL-1 含量極少，且主要是IL-1β，在OA 中，IL-1、特別是IL-1β 的含量異常升高，影響軟骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)其凋亡，打破軟骨基質(zhì)合成與代謝間的平衡，使滑膜出現(xiàn)炎性病變，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞。在關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中，軟骨細(xì)胞與滑膜細(xì)胞對(duì)于保持關(guān)節(jié)功能和結(jié)構(gòu)發(fā)揮著極其重要的作用，IL-1 參與關(guān)節(jié)軟骨與滑膜破壞的起始和進(jìn)展，IL-1 殺傷線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，軟骨細(xì)胞與滑膜細(xì)胞的能量供應(yīng)減少，使其活性下降，關(guān)節(jié)的彈性與潤滑功能降低。OA 發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)的功能和疼痛與關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌過多的IL-6 并釋放入血有關(guān)。TNF 按其結(jié)構(gòu)不同分為TNF-α 和TNF-β，其中由活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和T 細(xì)胞產(chǎn)生的為TNF-α。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 是參與OA 炎癥反應(yīng)的重要因素，TNF-α 可刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素-E2，增加軟骨下骨的吸收，引起關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原的破壞，在關(guān)節(jié)滑膜炎性病變及軟骨基質(zhì)的降解過程中起重要作用。
中醫(yī)理論認(rèn)為，OA 多因腎氣虧虛，關(guān)節(jié)失養(yǎng)，局部勞損癖阻，復(fù)受風(fēng)寒濕邪，經(jīng)絡(luò)不暢，氣血痹阻，關(guān)節(jié)寒凝、痰阻，不通則痛，故治療應(yīng)補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、勝濕止痛。在此基礎(chǔ)上擬定的榮骨定痛膏由山茱萸、杜仲、牛膝、當(dāng)歸、秦艽、獨(dú)活、川烏等四十余味中藥組成，在靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院臨床使用取得了較好的療效。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，榮骨定痛膏可明顯擴(kuò)大病變關(guān)節(jié)的活動(dòng)范圍，減小滑膜腫脹厚度，從而改善OA 關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)與功能。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)榮骨定痛膏在防治OA 的過程中，可使關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性細(xì)胞減少，不同程度地降低IL-1β、IL-6 與TNF-α 的水平，減輕由炎性細(xì)胞與上述促炎因子引起的局部與全身反應(yīng)。結(jié)果提示緩解OA 關(guān)節(jié)炎癥、抑制促炎因子IL-1β、IL-6 與TNF-α 的異常升高可能是榮骨定痛膏對(duì)OA 起治療作用的機(jī)制之一。
由于榮骨定痛膏有多種中藥制成，其膏液有一定的成膜性，在本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)給藥體積在50 μL以下時(shí)，在涂抹藥膏后用熱風(fēng)吹干，可在大鼠關(guān)節(jié)形成附著性很好的極薄藥膜，經(jīng)12 h 觀察藥膜無脫落和舔舐現(xiàn)象。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定每天給藥2 次，既可防止一次給藥造成藥膜太厚引起脫落和大鼠不適舔舐，又可保證每日給藥劑量，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
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