高能X射線對肺腺癌A549細胞ERCC1表達的影響論文
【關鍵詞】 肺腫瘤；a549細胞；切除修復交叉互補基因1；x線療法
【摘要】 目的 檢測高能x射線對肺腺癌a549細胞與順鉑耐藥相關的基因——切除修復交叉互補基因1（ercc1）表達的影響。方法 對a549細胞進行x射線照射，總劑量10 gy／(5 d·5f)。利用rt瞤cr檢測照射前及照射開始后第1～4周細胞的ercc1基因的表達；免疫組織化學sabc法檢測照射前后細胞ercc1蛋白的表達。結果 照射后第1～3周a549細胞ercc1 mrna及蛋白的表達水平比照射前顯著升高，差異有顯著性(f=152.00、26.63,q=6.03～28.31,p<0.01)。結論 肺腺癌a549細胞照射后可能出現(xiàn)順鉑耐藥。
effect of high瞖nergy x瞨ay on ercc1 expression in lung adenocarcinoma a549 cells
wang yu瞗ang, liu xi瞘uang, yin hong瞞ei, et al
(department of oncology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);
�。踑bstract］ objective to study the high瞖nergy x瞨ay on expression of ercc1 gene associated with cisplatin resistance in human lung adenocarcinoma a549 cell. methods the a459 cells were exposed to x瞨ay with a total dose of 10 gy/(5 d·5 f). the expression of ercc1 before and during 1-4瞱eek radiation was detected by rt瞤cr, and that before and after exposure of x瞨ay was detected by immunohistochemistry (sabc method). results on the first to third week of irradiation, the expressions of ercc1 mrna and protein were significantly higher than that before exposure (f=152.00,26.63;q=6.03-28.31;p<0.01). conclusion a549 cells may show cisplatin resistant after radiation.
�。踜ey words］ lung tumor; a549 cell; excision repair cross瞔omplementation group 1; x瞨ay therapy
肺癌是世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（nsclc）約占80％，而約2/3的nsclc病人在發(fā)現(xiàn)時已失去手術機會， 故放化療綜合治療已成為該類腫瘤常用的治療手段。Www.133229.COm再次或多次化療可以誘導多藥耐藥導致腫瘤的化療敏感性降低已無異議，但目前關于放療后耐藥基因及其蛋白表達情況以及相應的放療對化療敏感性的影響方面的研究較少,結果也不一致。因此，有針對性地對其研究十分必要。目前含鉑方案是nsclc一線標準化療方案。研究結果證實，ercc1可作為鉑類藥物化療效果的獨立預測指標[15]。本實驗針對體外培養(yǎng)的肺腺癌a549細胞株,檢測高能x射線照射前后與順鉑耐藥相關的`基因——切除修復交叉互補基因1（ercc1）及其編碼產(chǎn)物的表達隨時間變化情況，探討照射與肺腺癌a549細胞順鉑耐藥性的關系�，F(xiàn)將結果報告如下。
1 材料與方法
1.1 細胞培養(yǎng)
人肺腺癌細胞株a549由中國科學院上海生物學研究所提供。培養(yǎng)于含有體積分數(shù)0.10的小牛血清、10×104u/l的青霉素及10×104 g/l鏈霉素的rpmi 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分數(shù)0.05 co2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待細胞生長至指數(shù)生長期時進行x射線照射。
1.2 照射方法
照射源為直線加速器(varian 23ex，美國)，采用6 mv的x射線，源皮距為100 cm。細胞每次照射劑量為2 gy，每天1次，總劑量10 gy。劑量率為300 cgy/min。射野大小為15 cm×15 cm。把培養(yǎng)瓶置于照射野中心，每次照射后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，全部照射結束后，每隔1周取對數(shù)生長期的細胞凍存，用于rt瞤cr和sabc法檢測，每組實驗重復3次。
1.3 rt瞤cr檢測ercc1 mrna的表達
按trizol試劑盒(購自美國invitrogen公司)說明書及rt瞤cr試劑盒（購于大連寶生物工程有限公司）說明書的方法提取總細胞rna，反轉錄合成cdna。ercc1引物序列為：正向引物5′瞐ccc瞔tcgacgaggatga3′,反向引物 5′瞘atggc瞐tattcggcgtaggt3′，擴增片斷長度為127 bp。內(nèi)參照β瞐ctin擴增片段長約為621 bp， 引物序列為：前向引物5′瞐cactgtgcccatctacgagg勃3′， 反向引物5′瞐gggccggactcgtcatact3′。上述ercc1及內(nèi)參照β瞐ctin引物均由上海生工生物工程有限公司合成。逆轉錄總反應體系為20 μl，反應條件為：37 ℃ 5 min后，42 ℃ 1 h，72 ℃ 10 min。pcr反應體系為50 μl，反應條件為：94 ℃預變性5 min;然后94 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃ 復性65 s，共35個循環(huán);最后72 ℃充分延伸10 min后終止反應。取產(chǎn)物于15 g/l的 瓊脂糖凝膠上電泳。以β瞐ctin作為內(nèi)標，擴增產(chǎn)物長為621 bp，將標本的ercc1擴增產(chǎn)物平均吸光度與內(nèi)標的平均吸光度值相比，以比值作半定量分析。
1.4 ercc1蛋白表達sabc法檢測
x射線照射前對未進行處理的肺腺癌a549細胞，直接用免疫組織化學sabc法檢測ercc1蛋白的表達。細胞株在x射線照射后經(jīng)換液、傳代在1～4周檢測ercc1蛋白的表達。操作步驟按試劑盒說明書進行，鼠抗人ercc1單抗試劑盒(labvision，美國)為1∶50濃縮液。 ercc1陽性表現(xiàn)為細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀。照射前及照射后各時間點各選1張細胞分布比較均勻、細胞稠密適當?shù)募毎榔Ｃ繌埮榔S機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞占細胞總數(shù)的百分率。
1.5 統(tǒng)計學分析
采用ppms 1.5[6]統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所得數(shù)據(jù)均以±s表示，各組間兩兩比較采用lsd瞭檢驗。
2 結果
2.1 rt瞤cr檢測ercc1 mrna表達
照射前及照射1～4周ercc1 mrna表達分別為0.21±0.04、0.43±0.03、0.70±0.02、0.52±0.03和0.20±0.06，照射后第1～3周細胞ercc1 mrna的表達水平比照射前顯著升高，差異有顯著性(f=152.00,q=12.76 ～28.31,p<0.01)。第4周與照射前相比差異無顯著性（p>0.05）。
2.2 sabc法檢測ercc1蛋白的表達
照射前及照射1～4周ercc1蛋白的表達分別為（33.02±7.55）%、（51.02±8.59）%、（71.96±6.50）%、（59.33±7.00）%及(39.96±5.42)%，照射后第1～3周細胞ercc1蛋白的表達與照射前比較，差異有顯著性(f=26.63，q=6.03～13.06，p<0.05)。照射后4周時，與照射前比較差異無顯著性(p>0.05)。
3 討論
ercc1是一種高度保守的單鏈dna核酸內(nèi)切酶，位于染色體19q13.213.3，基因長度約為15 kb，其含有10個外顯子，編碼含297個氨基酸的蛋白質(zhì)。ercc1基因表達產(chǎn)物與dna修復酶缺乏互補基因f(xpf)形成緊密異二聚體(ercc1瞲pf)，該二聚體是一種特異性的連結5′端的核酸內(nèi)切酶，具有損傷識別和切除5′端的雙重作用。研究結果顯示，nsclc中存在ercc1表達，表達率為35％(22/63)[7]，本文實驗結果與之相似。說明該細胞本身就對順鉑有低度耐藥。照射后，細胞ercc1 mrna及蛋白表達在一定時間內(nèi)均比照射前顯著增高，說明放射治療也可引起肺腺癌a549細胞的順鉑耐藥，因此應注意放射治療對腫瘤化療耐藥的影響。其機制可能與照射后ercc1表達增高與照射引起的dna損傷后修復有關。照射一定時間后ercc1基因及蛋白表達又有回落，提示應避免在耐藥基因及蛋白表達水平較高時給予化療藥物治療，避免因放療誘導的順鉑耐藥，降低腫瘤綜合治療效果。另一方面提示放療聯(lián)合ercc1 mrna的靶向治療可能會取得更理想的抗腫瘤效應。
鉑類和第三代抗腫瘤新藥，如紫杉醇、多西紫杉醇、鹽酸吉西他濱的二聯(lián)作為目前腫瘤一線標準化療方案，但并不代表為最合理的治療方案。標準化療方案治療晚期nsclc病人療效差異較大，基于分子分型基礎上的個體化化療是目前研究熱點之一。藥物基因組學研究的個體化用藥選擇，是肺癌個體化治療研究的前沿，不同藥物效應預測分子可影響肺癌對不同化療藥物的反應。目前幾組根據(jù)不同相關藥物效應預測分子，如ercc1、rrm1、β2參⒐艿鞍注１澩鎪平選擇不同化療方案的ⅲ期臨床試驗正在進行中。我們實驗室也正在并陸續(xù)研究了放療后β2參⒐艿鞍注！rrm1、xpd、xrcc1、brca1等的表達，以進一步指導放療后個體化治療。
當然，本研究畢竟只是體外實驗，旨在對臨床體內(nèi)治療的方案提供理論參考，考慮到癌細胞組織來源不同，細胞體內(nèi)外生存環(huán)境的不同，照射方式、選取檢測的時間點、檢測指標的不同，體內(nèi)腫瘤病灶受病人的身體狀況、腫瘤的病理類型、病期等影響。照射后其耐藥基因及蛋白的表達程度可能也存在一定的差異。這些問題尚待進一步研究。
【參考文獻】
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