[摘要]中藥是中華傳統(tǒng)文化的瑰寶，是中華民族智慧的結(jié)晶。新方法技術(shù)的不斷應(yīng)用使得中藥研究與時俱進(jìn)。高通量轉(zhuǎn)錄組研究經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展，已經(jīng)成為一項較為成熟的研究手段。該文對中藥轉(zhuǎn)錄組研究概況進(jìn)行了綜述，比較了Roche公司的GS FLXTM平臺和Illumina公司的HiSeqTM 2000平臺兩大測序平臺，介紹了中藥轉(zhuǎn)錄組分析的流程，并以西洋參和金銀花為例，闡述了中藥轉(zhuǎn)錄組研究的特色。對傳統(tǒng)中藥進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組研究，可以從整體水平上了解目標(biāo)物種的功能基因概況，明確活性成分的代謝通路，為中藥研究奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論提供現(xiàn)代生物學(xué)闡釋。但是，目前的中藥轉(zhuǎn)錄組研究仍面臨著分子基礎(chǔ)薄弱，測序投資成本高，分析人員緊缺等困難。未來，伴隨測序技術(shù)的發(fā)展與完善，轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組、代謝組等組學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用，將為開創(chuàng)高通量篩選與高效率研發(fā)相結(jié)合的新型中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展模式奠定堅實的基礎(chǔ)。

　　[關(guān)鍵詞]中藥; 轉(zhuǎn)錄組; 西洋參; 金銀花

　　中藥經(jīng)過數(shù)千年的積累沉淀，承載著豐富的中醫(yī)理論。近年來，中藥研究進(jìn)展飛速，不僅為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)提供了巨大的新藥創(chuàng)制資源，更成為未來多靶點藥物研發(fā)的源泉，彌補(bǔ)了西藥治療位點單一的不足。目前，指紋圖譜技術(shù)和質(zhì)譜色譜技術(shù)的應(yīng)用，促進(jìn)了中藥有效成分的發(fā)現(xiàn)與鑒定[1-2]。然而尚有許多中醫(yī)藥理論因缺少現(xiàn)代自然科學(xué)的支撐和驗證，難以被社會所接受。轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)是指特定生物體在某種狀態(tài)下所有基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，轉(zhuǎn)錄組研究屬于功能基因組學(xué)研究的范疇，是連接基因組與蛋白質(zhì)組的紐帶。轉(zhuǎn)錄組研究著重于功能基因的表達(dá)，闡述生物學(xué)過程中的分子機(jī)理，已經(jīng)成為生物學(xué)領(lǐng)域較為成熟的研究手段。應(yīng)用高通量轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，可以從基因?qū)用嫔辖庾x中醫(yī)藥的現(xiàn)代內(nèi)涵，闡述中藥有效成分的代謝通路，為高通量發(fā)掘新型活性藥物成分奠定了堅實的基礎(chǔ)。自2009年以來，已有青蒿Artemisia annua[3]、西洋參Panax quinquefolius[4]、淫羊藿Epimedium Sagittatum[5]、金銀花Lonicera japonica[6-7]等數(shù)種傳統(tǒng)中藥材進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組的測序和分析。本文綜述了轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在中藥領(lǐng)域的研究進(jìn)展，對金銀花、西洋參等代表物種的研究進(jìn)行了詳細(xì)闡述，總結(jié)了中藥轉(zhuǎn)錄組分析的特色與不足，并對中藥轉(zhuǎn)錄組的研究進(jìn)行展望。

　　1中藥轉(zhuǎn)錄組研究

　　1.1中藥轉(zhuǎn)錄組研究概況

　　截至2014年1月，已有17種中藥進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組的研究。其中，開展研究最早的是青蒿A. annua[3]，隨后，中藥轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)展迅猛，2012年，有8種中藥進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究(表1)。除了胡黃連Picrorhiza kurrooa[8]和百合Lilium regale[9]，剩余的15種中藥的轉(zhuǎn)錄組測序工作均由中國人完成，體現(xiàn)了我國在中藥研究領(lǐng)域的霸主地位。早期的轉(zhuǎn)錄組測序主要以GS FLXTM System和GS FLXTM Titanium System平臺為主;到2012年，主要的測序平臺變?yōu)镮llumina HiSeqTM 2000;只有羅漢果Siraitia grosvenorii[10]和金銀花L. japonica[6]的轉(zhuǎn)錄組研究采用了Illumina GAⅡ platform平臺。金銀花L. japonica[6]注釋得到的基因數(shù)目最少，為5 330～6 591個，梅花鹿鹿茸Cervus nippon [14]注釋得到的基因數(shù)目最多，為138 642個。梅花鹿鹿茸轉(zhuǎn)錄組注釋得到了較多的基因，除了其本身基因豐富、可變剪切較多之外，還可能是由于其轉(zhuǎn)錄組的拼接效果較差，contig的N50為90 bp，使得原本由多個外顯子構(gòu)成的基因注釋成了分別的幾個較短的基因，從而使得注釋得到的基因數(shù)目偏多。

　　1.2中藥轉(zhuǎn)錄組的測序平臺比較

　　表1可知，中藥轉(zhuǎn)錄組研究的兩大平臺為Roche公司的GS FLXTM平臺和Illumina公司的HiSeqTM 2000平臺。GS FLXTM平臺的歷史可以追溯到2005年，454公司推出了基于焦磷酸測序法的高通量基因組測序系統(tǒng)[22]，這一技術(shù)開創(chuàng)了邊合成邊測序(sequencing-by-synthesis， SBS)的先河，其后的第二代基因組測序系統(tǒng)——Genome Sequencer FLXTM System(GS FLX)[23]就是在此基礎(chǔ)上建立起來的(圖1)。454公司被Roche公司收購之后，于2008 年10 月，推出了全新的測序試劑——GS FLXTM Titanium，全面提升了測序的準(zhǔn)確性、讀長和測序通量。目前，Roche 454 GS FLXTM Titanium System每次運(yùn)行能產(chǎn)生100萬條序列，平均讀長能達(dá)到400～600 nt，且第400個堿基的準(zhǔn)確率能達(dá)到99%。一次運(yùn)行所需時間不到10 h，便能獲得40 Gb左右的測序數(shù)據(jù)。HiSeqTM 2000平臺是Illumina公司Solexa平臺中最為成功的商業(yè)化型號，一次運(yùn)行可以獲得60億條序列，總數(shù)據(jù)量達(dá)到540～600 Gb，彌補(bǔ)了平均讀長較短的不足[24]。其測序的原理基于橋式PCR，HiSeqTM 2000平臺在此基礎(chǔ)上改進(jìn)了聚合酶，并使用甲酰胺變性，提高了橋式PCR的擴(kuò)增效率(圖1)。另外，HiSeqTM 2000平臺價格相對較低，因此，成為目前應(yīng)用最為廣泛的二代測序平臺。

　　2中藥轉(zhuǎn)錄組研究的特色

　　2.1中藥轉(zhuǎn)錄組分析流程

　　最早進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究的青蒿A. annua[3]，采用454 GS FLXTM平臺，共獲得406 044條序列，平均讀長為210個堿基;組裝得到42 678條contig和147 699條singleton。可以說，數(shù)據(jù)拼接是轉(zhuǎn)錄組研究中數(shù)據(jù)分析的第一步。根據(jù)測序平臺的不同，所采用的數(shù)據(jù)拼接軟件也各不相同。例如，在GS FLXTM平臺上，甘草Glycyrrhiza uralensis[11]、丹參Salvia miltiorrhiza[12]和人參Panax ginseng[15]均采用該平臺自帶的拼接軟件GS De Novo Assembler software v2.0.01 (454 Life Sciences， Roche)來完成序列的組裝;而在HiSeqTM 2000平臺上，首烏Polygonum cuspidatum[16]和紅花Carthamus tinctorius[17]采用的軟件為SOAPdenovo，白木香Aquilaria sinensis[21]采用的軟件為Trinity。

　　原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接之后，就可以進(jìn)行下一步的基因注釋。在基因注釋的過程中，通過不同數(shù)據(jù)庫的交叉比較，可以得到較好的注釋效果。通常第一步是在NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)的非冗余(non-redundant，nr)蛋白庫中通過BLASTX進(jìn)行比對，設(shè)定閾值為1×10-5。由于非冗余蛋白庫中存放著大量物種的蛋白質(zhì)序列，這一步通常耗費較多的時間，得到的注釋結(jié)果也較為全面。為了對注釋得到的基因進(jìn)行功能分類，常采用InterProScan[25]和Blast2GO[26]進(jìn)行GO(Gene Orthology，基因本體論)注釋。GO注釋包含三大層面：細(xì)胞組分(cellular component)、分子生物學(xué)功能(molecular function)和生物學(xué)途徑(biological process)，每個層面下又有不同級別的細(xì)分類，可以較為清晰的呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組的功能分類情況[27]。另外，常采用的還有COG(clusters of orthologous group，直系同源聚類分析)注釋[28]。通過COG注釋，可以根據(jù)同源比對注釋未知蛋白序列，還可以查看特定條目下的蛋白數(shù)目及缺失情況，從而能推測特定代謝通路是否存在。另一個可以用于基因通路分析的數(shù)據(jù)庫是KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書)[29]。KEGG 的PATHWAY 數(shù)據(jù)庫整合了分子互動網(wǎng)絡(luò)(比如通道，聯(lián)合體)的知識，實現(xiàn)了基因目錄與更高級別的細(xì)胞、物種和生態(tài)系統(tǒng)水平的系統(tǒng)功能的關(guān)聯(lián)。KEGG強(qiáng)大的圖形功能，能夠更為直觀全面的展現(xiàn)基因在代謝途徑上的分布以及各代謝通路之間的相互關(guān)系。早期研究中，青蒿A. annua[3]的轉(zhuǎn)錄組研究只使用了nr庫注釋和GO注釋，西洋參[4]P. quinquefolius的轉(zhuǎn)錄組研究只使用了nr庫注釋和KEGG注釋;而在近期研究中，金銀花L. japonica[6]、虎杖Polygonum cuspidatum[18]、杜仲Eucommia ulmoides[19]等的轉(zhuǎn)錄組研究全面的使用了nr庫注釋、GO注釋、COG注釋和KEGG注釋，標(biāo)志著中藥轉(zhuǎn)錄組研究的方法體系日趨完善。

　　2.2轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在中藥中的應(yīng)用及優(yōu)勢

　　雖然中藥轉(zhuǎn)錄組的研究尚處于起步階段，相關(guān)研究還很零散，但是，已有數(shù)種中藥物種的轉(zhuǎn)錄組研究取得了突破性進(jìn)展，顯示出轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在中藥研究中的巨大潛力，為后續(xù)中藥轉(zhuǎn)錄組的研究奠定了基礎(chǔ)。中藥轉(zhuǎn)錄組研究能夠通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)與中藥活性成分相關(guān)的新基因型和新代謝通路。例如，甘草G. uralensis[11]的轉(zhuǎn)錄組研究通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了甘草酸骨架合成相關(guān)的16個酶的候選基因，通過與Real-time PCR實驗相結(jié)合，又發(fā)現(xiàn)了9個可能參與甘草酸合成的基因，包括3個細(xì)胞色素P450和6個糖基轉(zhuǎn)移酶基因，加深了對甘草酸生物合成途徑的認(rèn)識。紅花C. tinctorius[17]的轉(zhuǎn)錄組研究著重對類黃酮和不飽和脂肪酸的生物合成通路進(jìn)行分析，KEGG預(yù)測結(jié)果表明相關(guān)通路基因在紅花中較為保守。另外，中藥轉(zhuǎn)錄組研究還能有效結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和生化實驗數(shù)據(jù)，明晰其活性成分的作用機(jī)制，從基因表達(dá)的層面上，更好地闡釋中醫(yī)藥理論的深刻內(nèi)涵。例如，西洋參P. quinquefolius[4]的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)合了甲基茉莉酸誘導(dǎo)實驗和Real-time PCR實驗，確定了5個可能參與人參皂苷合成的候選基因，包括一個細(xì)胞色素P450和4個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因。金銀花L. japonica[6]的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)合氣象色譜質(zhì)譜及高效液相色譜技術(shù)，建立起了基因表達(dá)量與活性物質(zhì)含量之間的關(guān)聯(lián)。

　　2.3代表中藥轉(zhuǎn)錄組研究解析

　　2.3.1 西洋參轉(zhuǎn)錄組研究 西洋參P. quinquefolius[4]是目前應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)中藥材之一，也是較早開展轉(zhuǎn)錄組研究的中藥材之一。西洋參轉(zhuǎn)錄組研究采用454 GS FLXTM Titanium System平臺，共得到209 747條高質(zhì)量序列，平均讀長為427個堿基，數(shù)據(jù)組裝得到16 592條contig和14 496條singleton。通過nr庫注釋，得到21 684個基因。通過KEGG通路注釋，發(fā)現(xiàn)西洋參的轉(zhuǎn)錄組中包含了甾醇骨架合成通路、油菜素類固醇合成通路和豆甾醇合成通路的所有基因。人參皂苷的合成途徑中有2步是由細(xì)胞色素P450基因催化的，第一步是催化達(dá)瑪烷轉(zhuǎn)化為原人參二醇，第二步是催化原人參二醇轉(zhuǎn)化為原人參三醇。因此，在西洋參轉(zhuǎn)錄的研究中，著重進(jìn)行了細(xì)胞色素P450的注釋和分析，共獲得了150個細(xì)胞色素P450基因，并進(jìn)行了甲基茉莉酸誘導(dǎo)實驗的驗證，篩選得到了一系列與人參皂苷合成相關(guān)的細(xì)胞色素基因。另外，該研究在新基因型發(fā)掘方面，還發(fā)現(xiàn)了235個糖基轉(zhuǎn)移酶基因。西洋參的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)合了高通量測序、數(shù)據(jù)分析和后期的實驗驗證，研究體系完整，實驗結(jié)果詳實。實現(xiàn)了對西洋參人參皂苷代謝通路的分析，有利于今后工程西洋參的研發(fā)和應(yīng)用。