一、立題依據(jù)(科學(xué)意義及國內(nèi)外現(xiàn)狀分析及參考文獻(xiàn))

　　惡性黑色素瘤是一種高度惡性且最具侵襲性的癌之一，多發(fā)生于皮膚，早期發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。對放、化療不敏感，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率增高，人們一直在期待著可以征服惡性黑素瘤的新的療法的出現(xiàn)!

　　最近大量的數(shù)據(jù)表明惡性腫瘤的發(fā)展與T-鈣粘蛋白的表達(dá)變化相關(guān).T-鈣粘蛋白已在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌[1-3] 、胃癌、胰腺癌、卵巢癌[4-9]等多種惡性腫瘤中被檢測到表達(dá)減少.最近的研究表明T/H—鈣粘蛋白在乳腺癌中的重新表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的生長,降低體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的侵襲潛能[1].T/H—鈣粘蛋白這個新型鈣粘蛋白分子在人類許多癌細(xì)胞中表達(dá)都降低表明它或許在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]及維持正常細(xì)胞的表型中起重要作用[11].

　　T/H—鈣粘蛋白與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系,也許它會為腫瘤的診斷和治療帶來新的契機.

　　T-鈣粘蛋白是否對惡性黑色素瘤也有作用，目前還沒有相關(guān)研究的報道，所以本實驗將進(jìn)行相關(guān)方面的探討性研究!

　　二、研究內(nèi)容及預(yù)期成果(說明具體研究內(nèi)容、創(chuàng)新點及擬解決的關(guān)鍵問題、預(yù)期成果及提供形式)

　　研究內(nèi)容：

　　第一部分：正常表皮組織、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中T-cadherin表達(dá)情況

　　第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建

　　第三部分：T-cadherin基因的真核表達(dá)及生物活性分析

　　創(chuàng)新點：首次將T-cadherin基因轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞

　　擬解決的關(guān)鍵問題：通過RT-PCR反應(yīng)擴增出T-cadherin的基因全長。

　　預(yù)期成果及提供形式：

　　觀察T-鈣粘蛋白在正常皮膚組織細(xì)胞、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況!

　　進(jìn)一步闡明T-鈣粘蛋白作用機制

　　T-鈣粘蛋白基因轉(zhuǎn)染入黑色素瘤細(xì)胞后觀察對其增殖和轉(zhuǎn)移活性的抑制情況，探索臨床診斷和治療黑色素瘤及其它腫瘤的方法!

　　三、研究方案(包括研究方法、技術(shù)路線、研究進(jìn)度安排)

　　研究方法：

　　第一部分：正常表皮組織、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中T-cadherin表達(dá)情況

　　免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)

　　1.材料：從正常人皮膚切取的痣組織，人黑色素瘤細(xì)胞株

　　2.主要試劑和溶液

　　(1)第一抗體：兔抗人T-cadherin 抗體

　　(2)第二抗體：生物素標(biāo)記羊抗兔IgG

　　(3) “三抗” ：鏈親和霉素標(biāo)記HRP

　　3.設(shè)備

　　4.方法

　　(1)冷凍切片的免疫染色程序

　　(2)活細(xì)胞的免疫染色程序

　　5.熒光顯微鏡檢

　　注意：為保證結(jié)果的可靠性應(yīng)該同時設(shè)有對照

　　陽性對照(正常組織) ;

　　陰性對照(PBS代替一抗)以證明抗體的特異性。

　　第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建

　　1.材料：

　　(1)組織和細(xì)胞

　　(2)菌株與質(zhì)粒

　　(3)工具酶

　　(4)試劑

　　(5)儀器

　　2.方法

　　(1)引物的設(shè)計

　　(2)總RNA的提�。寒惲蚯杷犭�-酚-氯仿抽提一步法

　　(3)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析其質(zhì)量，觀察所提RNA有無明顯降解;

　　(4)逆轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng) ：為了證實RT反應(yīng)的成功設(shè)管家基因GAPDH為內(nèi)對照

　　(5)PCR擴增 ：利用上下游引物，在DNA聚合酶下對目的片段進(jìn)行擴增，PCR過程設(shè)β-actin為內(nèi)對照

　　(6)PCR產(chǎn)物的回收、純化

　　(7)PCR產(chǎn)物的克隆

　　(8)DNA序列測定

　　(9)真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

　　(10)陽性重組質(zhì)粒的鑒定和篩選

　　(11)質(zhì)粒的大量提取

　　(12)轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞